Preparação de Biblioteca para o Protocolo de Sequenciação de 16S rRNA

Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR)

1. Prepare e limpe a estação de trabalho, capô PCR ou gabinete de biossegurança.
2. Descongele e mantenha os reagentes em gelo, agite suavemente e centrifugue antes de usar.
Prepare a reação de PCR em triplicados com os seguintes reagentes em tubos de PCR ou numa placa de 96 poços. Água livre de nucleases, 13,0 μL; Master Mix de PCR, 10,0 μL; primer 515f direto (10 μM), 0,5 μL; primer 806r reverso (10 μM), 0,5 μL; e DNA molde, 1,0 μL.
3. Ligue o termociclador com antecedência para que o instrumento aqueça.
4. Antes de colocar os tubos ou a placa no termociclador, centrifugue-os a 290 × g durante 1 minuto para reunir os reagentes no fundo do tubo ou poço.
5. Introduza os tubos ou a placa no termociclador e configure as seguintes condições de ciclagem:
(a) 94 °C durante 3 min.
(b) 94 °C durante 45 s.
(c) 50 °C durante 60 s.
(d) 72 °C durante 90 s.
(e) Repita os passos (a–d) 35 vezes para um total de 35 ciclos.
(f) 72 °C durante 10 min.
(g) Manter a 4 °C.
6. Uma vez concluídos, as amostras podem ser armazenadas em segurança a 4 °C ou − 20 °C neste ponto. Evite ciclos de congelação-descongelação.
7. Após a amplificação, junte amostras em triplicado em um único volume de 75 μL.

Eletroforese em Gel de Agarose

1. Prepare 1,5% de agarose em tampão 1× TAE num frasco. O volume variará dependendo do tamanho da caixa do gel.
2. Coloque o frasco no micro-ondas para dissolver a agarose e deixe ferver durante cerca de 15 s. Certifique-se de que a solução está visualmente clara.
3. Coloque a quantidade apropriada de SYBR Safe DNA Gel Stain (5 μL/50 mL) no frasco e agite suavemente para misturar.
4. Despeje lentamente a mistura no molde de gel, utilizando uma ponta de pipeta para remover quaisquer bolhas.
5. Coloque um pente de largura apropriada no gel, use uma ponta de pipeta para remover quaisquer bolhas e deixe o gel repousar durante cerca de 25 minutos para solidificar.
6. Uma vez que o gel tenha solidificado completamente, remova cuidadosamente o pente, levantando-o para cima. Não danifique os poços ao remover o pente.
7. Coloque a bandeja de gel na caixa de gel. (Verifique a orientação da câmara de tampão; o gel deve correr dos eletrodos pretos para os vermelhos.)
8. Adicione 1× buffer TAE apenas para imergir ligeiramente o gel, mas cobrindo completamente os poços.
9. Misture cada amostra com o corante de carregamento (por exemplo, corante de carregamento 6×: 1 μL de corante de carregamento + 5 μL de produto de PCR).
10. Carregue a escada de ADN e as amostras nos poços do gel.
11. Quando terminar de carregar as amostras, incluindo o controlo sem template (NTC), nos diferentes poços do gel, coloque a tampa na câmara de buffer e ligue os cabos na caixa de eletroforese.
12. Ligue a caixa de eletroforese e defina a voltagem e o tempo de corrida apropriados; defina como constante em volts.
13. Quando o gel tiver terminado de correr, retire a bandeja do gel da câmara de buffer e deslize cuidadosamente um transiluminador UV ou uma câmara de imagem para visualização do gel e da banda esperada do amplicon.

Quantificação e Normalização

1. Quantifique os amplicões de PCR utilizando um kit de quantificação de DNA. Utilizámos o Kit de Análise de dsDNA Quant-iT PicoGreen seguindo as instruções do fabricante.
2. Após a quantificação de cada pool de amostras, transfira quantidades equivalentes de 240 ng de amplicão de cada amostra para um tubo estéril ou tubos.

Limpeza do Produto de PCR

1. Utilize um kit de purificação de PCR para os produtos de PCR agrupados. O kit de purificação de PCR QIAquick é utilizado de acordo com as instruções do fabricante.
2. A biblioteca de pool limpa eluída deve estar pronta para submissão a uma instalação de sequenciamento. A melhor garantia de qualidade e controlo de qualidade (QA/QC) é quantificar a biblioteca total por PCR quantitativa (qPCR).

qPCR

1. Utilize o Kit de Quantificação KAPA Library para plataformas Illumina, seguindo as instruções do fabricante.
2. Uma vez que a biblioteca esteja quantificada com precisão por qPCR, deve estar pronta para sequenciação.
3. Esta biblioteca deve ser corrida num sequenciador Illumina MiSeq utilizando uma química de pares de extremidades 2 × 250.

Referência:

1. Maldonado J, Yaron J R, Zhang L, et al. Preparação de bibliotecas de sequenciação de próxima geração para análise do microbioma de 16S rRNA após tratamento com serpin[J]. Serpins: Métodos e Protocolos, 2018: 213-221.