Identificação de Modificações de RNA m6A por Protocolo de Sequenciação Nanopore

Preparação da Biblioteca de Sequenciação Direta de RNA

Preparação do RNA de Entrada

1. Agrupe cada curlcake (para não modificado e modificado em m6A separadamente) num tubo de DNA LoBind que conterá 200 ng de cada um (800 ng no total).
2. Ajuste o volume para 9μL com água livre de nucleases e misture bem por inversão.
3. Centrifugue brevemente num microfuge.
Ligação do Adaptador
1. Numa tubo de PCR de parede fina de 0.2 mL, misture os reagentes do kit de sequenciação direta de RNA.
2. Misture por pipetagem e centrifugue.
3. Incube a reação por 10 min à temperatura ambiente. Entretanto, prossiga para a etapa de transcrição reversa.

Transcrição Reversa e Limpeza

1. Misture os reagentes para fazer a mistura mestre de transcrição reversa.
2. Adicione a mistura mestre ao tubo de PCR de 0.2 mL contendo o RNA ligado ao adaptador RT da etapa de "Ligação do Adaptador RT" acima. Misture por pipetagem.
3. Adicione 2μl de transcriptase reversa SuperScript III à reação e misture por pipetagem.
4. Coloque o tubo num termociclador, incube a 50 °C por 50 min e a 70 °C por 10 min, e leve a amostra a 4 °C antes de prosseguir para a próxima etapa.
5. Transfira a amostra para um tubo Eppendorf DNA LoBind de 1.5 mL.
6. Ressuspenda o estoque de esferas Agencourt RNAClean XP por vortexing, adicione 72μL de esferas à reação de transcrição reversa e misture por pipetagem.
7. Incube num Hula Mixer por 5 min à temperatura ambiente.
8. Prepare 200μL de etanol a 70% fresco em água livre de nucleases.
9. Centrifugue a amostra e forme um pellet num ímã.
10. Mantenha o tubo no ímã e lave as esferas com 150μL de etanol a 70% sem perturbar o pellet.
11. Remova o etanol e descarte. Centrifugue os tubos, coloque-os de volta no suporte magnético e remova qualquer etanol residual.
12. Remova o tubo do suporte magnético e ressuspenda o pellet em 20μL de água livre de nucleases. Incube por 5 min à temperatura ambiente.
13. Pellete as esferas no ímã até que o eluato esteja claro e incolor.
14. Pipete 20μL do eluato para um tubo Eppendorf DNA LoBind limpo de 1.5 mL.
15. Meça cDNA e RNA num Qubit ou similar.

Ligação do Adaptador RMX e Limpeza

1. Numa tubo Eppendorf DNA LoBind limpo de 1.5 mL, misture os reagentes.
2. Misture por pipetagem e incube por 10 min à temperatura ambiente.
3. Ressuspenda o estoque de esferas Agencourt RNAClean XP por vortexing, adicione 40μL de esferas à reação de ligação do adaptador e misture por pipetagem.
4. Incube num Hula Mixer por 5 min à temperatura ambiente.
5. Centrifugue a amostra e forme um pellet num ímã. Mantenha o tubo no ímã e pipete o sobrenadante.
6. Adicione 150μL do tampão de lavagem (WSB) fornecido no kit de sequenciação direta de RNA às esferas. Ressuspenda as esferas batendo no tubo. Retorne o tubo ao suporte magnético, deixe as esferas pelotarem e pipete o sobrenadante. Repita. Deixe secar ao ar por 2 min.
7. Remova o tubo do suporte magnético e ressuspenda o pellet em 21μL de tampão de eluição. Incube por 10 min à temperatura ambiente.
8. Pellete as esferas no ímã até que o eluato esteja claro e incolor.
9. Remova e retenha 21μL do eluato num tubo Eppendorf DNA LoBind limpo de 1.5 mL.
10. Meça cDNA e RNA num Qubit ou similar.
11. Misture a biblioteca com 17.5μL de água.
12. Adicione 37.5μL de tampão RRB (misture o RRB por vortexing antes de usar) e misture bem. A biblioteca está agora pronta para ser carregada na célula de fluxo.

Referência:

1. Liu H, Begik O, Novoa E M. EpiNano: Detecção de Modificações de RNA m6A Usando Sequenciação Direta de RNA Oxford Nanopore[M]//Modificações de RNA. Humana, Nova Iorque, NY, 2021: 31-52.