Um Guia de Sequenciação de Metilação de DNA em Células Únicas: Do Experimento Úmido à Análise de Dados

O que é a metilação de DNA em células únicas?

A metilação do DNA é um marcador epigenético herdado durante a divisão celular que afeta a função biológica das células. As diferenças entre células podem corresponder a diferenças nos marcadores epigenéticos, que por sua vez estão relacionados à expressão génica. A análise de metilação em todo o genoma a nível de célula única proporcionará uma visão sobre a regulação transcricional e a heterogeneidade celular. Explorar as diferenças epigenéticas entre células é fundamental para compreender a heterogeneidade dos tecidos. Avanços recentes no mapeamento da metilação do DNA a nível de célula única oferecem uma oportunidade para a descoberta de tal heterogeneidade.

Como realizar o perfilamento de metilação de DNA em células únicas?

Metodologia de Conversão de Bisulfito

O método de conversão por bisulfito é considerado o padrão ouro para a análise de metilação do DNA. É preferido pelos investigadores devido à sua alta taxa de conversão (>99%), reprodutibilidade e simplicidade de uso através de kits comerciais.

As principais diferenças entre RRBS e WGBS.

RRBS e WGBS são métodos populares para análise de metilação em todo o genoma. Ambos os métodos incluem conversão com bisulfito e preparação para NGS. A principal diferença é que o RRBS utiliza endonucleases de restrição apropriadas e seleção de tamanho para filtrar regiões ricas em GC. O GBS (especialmente o MethylC-seq) tem a vantagem de conseguir cobrir a maioria dos CpGs no genoma. O processo de purificação e triagem é relativamente simples com WGBS em comparação com RRBS. Prevenir perdas por degradação durante a transformação com bisulfito em WGBS é considerado relativamente importante e, portanto, muitos métodos de célula única baseados em WGBS são frequentemente baseados em PBAT.

scRRBS e scWGBS (Ahn J et al., 2021)

O fluxo de trabalho do RRBS de célula única

O RRBS convencional pode ser dividido em cinco etapas. A primeira etapa é a digestão do DNA com endonucleases de restrição, a segunda etapa é a ligação de splices e o seu pré-tratamento, a terceira etapa é a seleção de locais ricos em GC, a quarta etapa é a transformação com bisulfito e, finalmente, o processo de amplificação antes da sequenciação. Estes processos incluem várias etapas de purificação, com uma etapa final de amplificação que é projetada para compensar as perdas nos processos anteriores. Ao contrário do RRBS convencional, o RRBS de célula única não garante que o DNA alvo permaneça intacto durante o processo final de amplificação devido à pequena quantidade de DNA proveniente de uma única célula pelos métodos convencionais. Portanto, o RRBS de célula única é refinado em termos de redução de perdas. O scRRBS é um método que se concentra em minimizar as perdas que ocorrem durante o processo de purificação. A redução de perdas é alcançada através da digestão com endonucleases de restrição, do processo de ligação de splices e da transformação de bisulfitos em um único tubo sem purificação.

O fluxo de trabalho da WGAS de célula única

WGBS é sequenciação de metilação de todo o genoma e fornece uma cobertura genómica mais abrangente do que o método RRBS, que cobre apenas ilhas CpG. O WGBS é mais simples do que o RRBS, pois não requer digestão enzimática, seleção de tamanho e etapas de maceração e purificação da amostra. No entanto, a perda de amostra no WGBS deve-se principalmente à conversão de bisulfito. Também pode ser otimizado pelo método PBAT.

(a) Visão geral do método de marcação com adaptadores pós-bisulfito (PBAT) para prevenir perdas devido à degradação durante o processo de conversão com bisulfito. (b) Visão geral da reação em tubo único. (Ahn J et al., 2021)

Metodologia Sem Conversão BS

Os métodos para sequenciação de metilação sem conversão BS dividem-se em duas categorias principais: aqueles que exploram a ligação de afinidade da metilcitosina e aqueles que exploram a sensibilidade das endonucleases de restrição à metilcitosina. O MBD-seq e o MeDIP-seq são métodos representativos com perfis baseados em afinidade. Os métodos baseados em afinidade não são adequados para aplicação em sequenciação de células únicas porque se baseiam em fragmentos de DNA para produzir um perfil médio de metilação de DNA e, portanto, não conseguem distinguir diferenças nos padrões de metilação de DNA em células individuais. No entanto, ao contrário dos métodos baseados em afinidade, os métodos baseados em MSRE foram refinados para uso em sequenciação de células únicas, e o scCGI-seq mede a metilação de forma semelhante ao Methyl-seq.

Atualmente, o método de conversão por bisulfito continua a ser um dos ensaios de metilação mais comuns. Portanto, a próxima apresentação sobre métodos analíticos utiliza o método de conversão por bisulfito como exemplo.

Análise de dados de sequenciação de metilação de DNA de células únicas

Métodos de análise da metilação do DNA. (Ahn J et al., 2021)

Avaliação da qualidade dos dados

Após a realização de experiências de sequenciação, incluindo RRBS e WGBS, os dados de sequenciação precisam de ser pré-processados. Os passos de pré-processamento podem ser divididos em controlo de qualidade (QC) dos dados, aparo das leituras de sequenciação e comparação das leituras de sequenciação. A primeira parte do QC mede a qualidade geral dos dados básicos de sequenciação utilizando programas de software como o FastQC. Após uma avaliação minuciosa da qualidade da sequência, deve-se determinar a eficiência de conversão da sequenciação de bisulfito. Para amostras com baixas taxas de conversão de sulfito pesado, é desafiador distinguir entre bases sequenciadas como citosinas no local CpG e citosinas verdadeiramente metiladas ou erros de sequenciação. Isso desempenha um papel como um fator de confusão na análise subsequente, incluindo a identificação de regiões diferencialmente metiladas. A eficiência de conversão pode ser obtida diretamente do DNA lambda não metilado adicionado, calculando a proporção de bases convertidas na posição da citosina ou utilizando programas de software disponíveis.

Recorte e comparação de sequências

A recorte de sequências é realizado utilizando o software e as leituras de sequências aparadas são então comparadas ao genoma de referência, o que pode detectar e remover chamadas de bases de baixa qualidade ou ambíguas, bem como sequências de adaptadores que podem ter sido introduzidas durante a preparação da biblioteca.

Análise de metilação utilizando o nível de metilação

O principal objetivo da análise de metilação é explorar a evidência epigenética de diferenças entre as amostras constituintes, órgãos e estados de doença (incluindo o câncer). Para descobrir essas diferenças, é necessário um valor numérico que caracterize este conceito, comumente um valor beta, que é calculado usando a fórmula abaixo. Após a chamada de metilação, são realizadas análises subsequentes, como análise visual de t-SNE, análise de agrupamento e identificação de citosinas metiladas diferencialmente (DMCs) ou regiões metiladas diferencialmente (DMRs).

Análise de metilação utilizando padrões de metilação de leituras

Análises recentes de metilação têm utilizado os padrões de metilação de cada leitura para diagnosticar doenças, particularmente o câncer. Este novo conceito analítico baseia-se na propriedade biológica da metilação, ou seja, a tendência de manter a metilação entre sítios CpG adjacentes, a menos que ocorra metilação ab initio. Este método de análise de padrões de leituras é capaz de detectar moléculas de DNA com sinais de doença e tem o potencial de aumentar as chances de deteção de sinais de doença. Por exemplo, um grande estudo de biópsia líquida projetou um classificador integrado para classificar tipos de tumores com base na análise de padrões de leituras e mostrou resultados significativos na deteção de cânceres em estágio inicial. Além disso, a quantificação de moléculas de DNA derivadas de tumores por padrões de metilação é outra forma de avaliar a carga tumoral.

Análise de metilação utilizando padrões de metilação de leituras. (Ahn J et al., 2021)

Aplicações da sequenciação de metilação de DNA a nível de célula única

Pesquisa sobre o desenvolvimento celular

A maturação das células germinativas ou células embrionárias é influenciada pela expressão de genes específicos, que correlacionam com o nível de metilação no DNA. Com base no perfil de metilação das células embrionárias pré-implantacionais, por exemplo, os mecanismos de metilação celular pré-implantacional e os seus fenómenos foram investigados utilizando sequenciação de metilação de célula única ao rastrear linhagens embrionárias precoces. A equipa observou que a metilação não-CpG se acumula durante a maturação do oócito, sugerindo um papel diferente para a metilação não-CpG em comparação com a metilação CpG durante a maturação do oócito.

Investigação relacionada com doenças

Em pacientes com a doença, o padrão de metilação do DNA difere do de indivíduos saudáveis. Entre as várias doenças, o câncer, em particular, apresenta um padrão de metilação do DNA que as células normais não têm, levando a diferenças nos níveis de expressão gênica. No estudo de cânceres com esta heterogeneidade, é necessário utilizar uma abordagem multi-ômica que combine variação genómica e expressão de RNA para análise. Por exemplo, um grupo de pesquisa desenvolveu recentemente um método chamado scTrio-seq2, que integra dados de transcriptoma de célula única e sequenciação de metilação de célula única. Vários estudos demonstraram que uma abordagem multi-ômica utilizando sequenciação de metilação de célula única (sc-methyl-seq) pode superar as limitações dos métodos anteriores e proporcionar uma melhor discriminação. Assim, o sc-methyl-seq pode ser utilizado em vários campos para abordar questões fundamentais relacionadas a processos biológicos e doenças.

Referência

1. Ahn J, Heo S, Lee J, et al. Introdução aos métodos de perfilagem de metilação de DNA em células únicas[J]. Biomoléculas, 2021, 11(7): 1013.