Método de Tipagem HLA de Comprimento Total Usando o Protocolo de Sequenciamento PacBio SMRT

Geração de Amplicões HLA

Extração de DNA

1. Pipetar 20 μl de proteinase K para o fundo de um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
2. Adicione 200 μl de amostra de sangue seguido de 200 μl de Buffer AL ao tubo de microcentrífuga. Misture a amostra por pulsos de vortex durante 15 s.
3. Incubar a 56 °C durante 10 min.
4. Centrifugue o conteúdo e adicione 200 μl de etanol (96-100%) à amostra.
5. Misture novamente com um pulso de vortexação de 15 s, seguido de centrifugação para remover as gotas do interior da tampa.
6. Centrifugar a 6000 × g (8000 rpm) durante 1 minuto.
7. Descarte o tubo de coleta contendo o filtrado e coloque a coluna de centrifugação num tubo de coleta limpo de 2 ml.
8. Adicione 500 μl de Buffer AW1 sem molhar a borda e centrifugue a 6000 × g (8000 rpm) durante 1 minuto.
9. Coloque a coluna de centrifugação em outro tubo de coleta limpo de 2 ml e descarte o tubo de coleta que contém o filtrado.
10. Adicione 500 μl de Buffer AW2 à coluna sem molhar a borda. Feche a tampa e centrifugue à velocidade máxima (20.000 × g; 14.000 rpm) durante 3 minutos.
11. Coloque novamente a coluna de centrifugação num novo tubo de coleção de 2 ml e descarte o antigo tubo de coleção com o filtrado.
12. Centrifugue a coluna à velocidade máxima durante 1 minuto.
Coloque a coluna de centrifugação num tubo de microcentrifugação limpo de 1,5 ml e descarte o tubo de coleta que contém o filtrado.
14. Adicione 200 μl de Buffer AE ou água destilada. Incube à temperatura ambiente (15-25 °C) durante 1 minuto e, em seguida, centrifugue a 6000 × g (8000 rpm) durante 1 minuto.

Avaliação da Qualidade e Quantidade do DNA

1. Analisar a qualidade do DNA em gel de agarose a 1% (p/v) utilizando 3 μl de DNA extraído.
2. Quantifique o DNA utilizando 1 μl de DNA e analise de acordo com o protocolo do fabricante.

Amplificação por PCR de Genes HLA de Comprimento Total

1. Todas as reações devem ser realizadas em gelo.
2. Descongele o tampão 10× Long Range PCR, a mistura de dNTP e H livre de nucleases.₂O, e soluções de primer. Misture as soluções cuidadosamente e centrifugue brevemente antes de usar.
3. Prepare uma mistura de reação. Prepare uma mistura de reação separada para cada primer de amplificação.
4. O HLA-DQB1 requer a adição de Q-Solution e o dobro da quantidade de enzima Long-Range por reação.
5. Vortexe a mistura de reação de forma completa e centrifugue brevemente.
6. Adicione a mistura de reação em cada tubo de PCR. O volume apropriado é de 25 μl menos a quantidade de DNA adicionada no próximo passo.
7. Adicione 1-4 μl de DNA molde (50-200 ng) a cada tubo contendo a mistura de reação.
8. Programe o ciclista térmico de acordo com as instruções do fabricante.
9. Após a amplificação, armazene as amostras durante a noite a 2-8 °C.

Avaliação da Qualidade do Amplicão de PCR

1. Quantifique os amplicões dos genes de classe I e II utilizando 1 μl do ensaio de PCR e analise de acordo com o protocolo do fabricante.
2. Analise os produtos de PCR em gel de agarose a 1% (p/v) utilizando 3 μl de cada ensaio de PCR.
3. Confirme o tamanho do amplicão por PCR.

Purificação de Produto de PCR

Todos os amplicões dos genes de classe I e II foram purificados utilizando um kit.
2. Mantenha as esferas AMPure à temperatura ambiente durante meia hora.
3. Adicione 0,6× de esferas AMPure (por exemplo, para 100 μl adicione 60 μl de esferas AMPure) ao amplicão de PCR e misture pipetando para cima e para baixo.
4. Gire o tubo para coletar as esferas e mantenha-o à temperatura ambiente durante 15 minutos.
5. Mantenha o tubo num suporte de esferas magnéticas até que as esferas se acumulem de um lado do tubo e a solução pareça clara.
6. Mantenha os tubos no suporte de esferas magnéticas e transfira o sobrenadante limpo para outro tubo, utilizando uma pipeta.
7. Não remova o tubo do suporte de esferas magnéticas e adicione etanol a 70% recém-preparado ao tubo Eppendorf do lado oposto das esferas.
8. Utilize um volume suficiente de etanol a 70% para encher o tubo sem perturbar as esferas. Deixe o tubo repousar durante 30 s.
9. Após 30 s, pipete e descarte o etanol a 70%.
10. Repita os passos 6-8 acima.
11. Remova o etanol residual a 70% com uma breve centrifugação e coloque de volta no suporte magnético.
12. Retire qualquer etanol a 70% que reste com uma pipeta.
13. Deixe as contas secar ao ar (com as tampas dos tubos abertas) durante 30-60 s.
14. Remova o tubo do suporte magnético e adicione 50 μl de tampão de eluição à amostra. Elua o DNA das esferas.
15. Vortex durante 30 s e incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
16. Coloque o tubo de volta no suporte magnético para eluir a amostra das esferas e transfira a amostra para um tubo limpo.

Avaliação da Qualidade do Amplicão de PCR Purificado

1. Quantifique os amplicões purificados dos genes de classe I e II utilizando 1 μl de DNA e analise de acordo com o protocolo do fabricante.
2. Verifique o tamanho do amplicão e dos reagentes de acordo com o protocolo do fabricante.
3. Confirme o tamanho dos amplicões de acordo com o tamanho esperado.

Preparação da Biblioteca HLA SMRTbell

1. Prepare a biblioteca SMRTbell utilizando o kit de preparação de template SMRT de acordo com o protocolo do fabricante. O protocolo de preparação de template SMRT consiste nos seguintes passos.
2. Pooling equimolar de amplicons de PCR purificados.
3. Reparar danos no DNA.
4. Purifique o DNA reparado.
5. Ligação de extremidades cegas dos adaptadores SMRTbell aos amplicons reparados nas extremidades.
6. Adicione exonuclease e incube.
7. Purificar os templates SMRTbell.
8. Avaliação da Qualidade da Biblioteca SMRTbell.
9. Anexar primers aos templates SMRTbell.
10. Ligar a polimerase aos templates SMRTbell.

Pooling Equimolar de Amplicões de PCR Purificados

1. Pool de concentração molar igual de HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1 e HLA-DRB1 como uma amostra.
2. Mantenha o volume alvo do pool final (μl) em 20 μl e a concentração alvo por amplicão (nM) para o pool equimolar em 4 nM.

Reparar Danos no DNA em Amplicões

1. Descongele o componente do kit em gelo e adicione os reagentes num tubo de microcentrífuga.
2. Misture o conteúdo pipetando e centrifugue o conteúdo do tubo.
3. Incubar a 37 °C durante 20 minutos ou mais, em seguida, retornar a reação a 4 °C durante 1 minuto.

Purificar o DNA Reparado

1. Traga o reagente de bead à temperatura ambiente e misture bem até que a solução apareça homogénea.
Adicione 0,6× volume de esferas magnéticas AMPure PB ao reação de reparo das extremidades e misture pipetando para cima e para baixo.
3. Gire (ou pulse) o tubo para coletar as contas e transfira o tubo para um misturador vortex.
4. Permita que o DNA se ligue às esferas agitando a 2000 rpm durante 10 minutos à temperatura ambiente até que a mistura de esferas/DNA pareça homogénea.
5. Gire o tubo durante alguns segundos para coletar as contas.
6. Coloque o tubo num suporte de esferas magnéticas até que as esferas se acumulem de um lado do tubo e a solução apareça clara.
7. Mantendo os tubos no suporte de esferas magnéticas, remova o sobrenadante clarificado para outro tubo por pipetagem.
8. Não remova o tubo do suporte de esferas magnéticas e adicione etanol a 70% recém-preparado ao tubo Eppendorf do lado oposto das esferas.
9. Utilize um volume suficiente de etanol a 70% para encher o tubo sem perturbar as esferas. Deixe o tubo descansar durante 30 s.
10. Após 30 s, pipete e descarte o etanol a 70%.
11. Repita os passos 6-8 acima.
12. Remova o etanol residual a 70% com uma breve centrifugação e coloque de volta no suporte magnético.
13. Retire com uma pipeta qualquer etanol a 70% que reste.
14. Deixe as contas secar ao ar (com as tampas dos tubos abertas) durante 30-60 s.
15. Remova o tubo do suporte magnético e adicione 34 μl de Tampão de Eluição à amostra. Elua o DNA das esferas.
16. Vortex durante 10 min a 2000 rpm.
17. Coloque o tubo de volta no suporte magnético para eluir a amostra das esferas e transfira a amostra para um tubo limpo.
18. O DNA reparado pode ser armazenado durante a noite a 4 °C ou a −20 °C por períodos mais longos.

Ligação de Extremidades Cegas dos Adaptadores SMRTbell aos Amplicões Reparados nas Extremidades

1. Descongele os reagentes em gelo e misture-os num tubo de microcentrífuga conforme o protocolo do fabricante.
2. Adicione o adaptador ao DNA, enquanto todos os outros componentes devem ser adicionados ao Master Mix. Complete o volume total para 40 μl com água.
3. Misture bem a reação pipetando e centrifugue o conteúdo do tubo.
4. Incubar a 25 °C durante 15 min.
5. Incubar a 65 °C durante 10 min para inativar a ligase e armazenar a 4 °C.
6. Não pare e prossiga com a adição de exonuclease após este passo.

Adicionar Exonuclease e Incubar

1. Descongele o reagente em gelo e misture bem a reação pipetando.
2. Centrifugue rapidamente o conteúdo do tubo numa microcentrífuga.
3. Adicione os reagentes conforme o protocolo do fabricante, misture por pipetagem e centrifugue.
4. Incubar a 37 °C durante 1 h, depois devolver a reação a 4 °C.

Avaliação da Qualidade da Biblioteca SMRTbell

1. Quantifique as bibliotecas utilizando 1 μl de DNA de acordo com o protocolo do fabricante.
2. Verifique o tamanho da biblioteca.

Anexar Primers aos Templates SMRTbell

1. No calculador, clique na opção número de Células SMRT que especifica quantas Células SMRT preparar, e o Calculador determina a quantidade de amostra necessária.
2. Adicione a concentração da biblioteca e o tamanho das bibliotecas.
3. Protocolo: Selecione o método de carregamento como MagBead.
4. Kit de Ligação: Selecione a polimerase de sequenciação como P6v2.
5. Protocolo de Preparação: Pequena escala.
6. Armazenamento a Longo Prazo: Não.
7. Complexo de Controlo do DNA: Sim.
8. Reutilização Complexa: Não.
9. Concentração Padrão: Sim
10. Clique na secção Parâmetros Personalizados.
11. Concentração na Placa: Utilize a recomendação padrão de 0,01 nM.
12. Rácio do Complexo de Controlo de DNA em relação ao Modelo: Use a recomendação padrão de 1,2%.
13. Polimerase: Relação de Template: Utilize a recomendação padrão de 10:1.
14. Primer: Proporção do Template: Utilize a recomendação padrão de 20:1.
Para o manual de condicionamento:
(a) Dilua e aqueça previamente o Primer de Sequencia de 5000 a 150 nM em Tampão de Eluição.
(b) Incubar os primers diluídos a 80 °C durante 2 minutos e depois manter a 4 °C.
Para o primer de recocção:
(a) Numa nova tubo, adicione a quantidade apropriada de reagentes.
(b) Misture o conteúdo com pipetagem, centrifugue brevemente e incubar a 20 °C durante 30 min.
(c) Transferir para um local a 4 °C para uso imediato ou armazenar a −20 °C.

Ligar a Polimerase a Templates SMRTbell

1. Descongele os reagentes para a diluição da polimerase e prepare a reação em gelo.
2. Dilua a polimerase num tubo de 0,5 ml, mistura com uma pipeta e centrifuga brevemente.
3. Para a ligação da polimerase, adicione os componentes, misture por pipetagem e centrifugue brevemente.
4. Incubar a 30 °C durante 30 min e manter a 4 °C.

Ligar o Complexo de DNA ao MagBead

1. Dilua o Complexo de Controlo Interno de DNA.
2. Dilua ainda mais a primeira diluição do controlo de DNA.
3. Dilua o complexo da amostra.
4. Mantenha as esferas magnéticas frias.
5. Adicione 73,9 μl de MagBeads a um tubo vazio e coloque-o no suporte magnético.
6. Colete as esferas. Remova o sobrenadante e descarte.
7. Adicione 73,9 μl de tampão de lavagem MagBead e lave aspirando e dispensando lentamente dez vezes.
8. Colete as esferas. Remova o sobrenadante e descarte.
Adicione 73,9 μl de MagBead Binding Buffer e misture aspirando e dispensando lentamente dez vezes.
Adicione 73,9 μl de esferas lavadas a um novo tubo e coloque-o num suporte magnético.
11. Colete as contas. Remova o sobrenadante e descarte.
Adicione 19 μl do complexo de amostra diluído e misture aspirando e dispensando lentamente dez vezes.
13. Incubar num rotador a 4 °C durante 20 min (até 2 h).
14. Mantenha o tubo contendo o complexo MagBead numa placa magnética.
15. Colete as pérolas. Remova o sobrenadante claro e descarte.
Adicione 19 μl de tampão de ligação MagBead e misture aspirando e dispensando lentamente dez vezes.
17. Colete as esferas colocando o tubo no suporte magnético. Remova o sobrenadante e descarte.
Adicione 19 μl de tampão de lavagem MagBead e lave aspirando e dispensando lentamente dez vezes.
19. Cole as esferas colocando o tubo no suporte magnético. Remova o sobrenadante e descarte.
Adicione 1,2 μl de Diluição de Controlo de DNA.
Adicione 17,8 μl de MagBead Binding Buffer e misture aspirando e dispensando lentamente dez vezes.
22. Manter a 4 °C até à utilização.

Sequenciação

1. Carregamento da placa de amostras: Transfira os volumes especificados (19 μl) para poços separados de uma nova placa de PCR de 96 poços para processamento no PacBio RS.
2. Carregue os reagentes, pontas e células SMRT no sequenciador e inicie a sequenciação: Os reagentes e a célula SMRT variam consoante o tipo de sequenciador utilizado, por isso consulte para mais detalhes.

Referência:

1. Ambardar S, Gowda M. Método de tipagem HLA de comprimento total de alta resolução utilizando tecnologia de sequenciação de terceira geração (Pac-Bio SMRT) [M]//Tipagem HLA. Humana Press, Nova Iorque, NY, 2018: 135-153.