Protocolo de Genotipagem HLA de Comprimento Total com Sequenciação por Nanoporos

Introdução ao Genotipagem Completa de HLA com Sequenciação por Nanopore

Os genes HLA exibem um polimorfismo significativo e desempenham uma função crucial no sistema imunitário através da apresentação de antígenos peptídicos às células T. A genotipagem precisa destes genes tem uma importância essencial em vários campos, incluindo transplante, estudos sobre associação a doenças e imunoterapia. A tecnologia de sequenciação por nanopore, exemplificada por plataformas como Oxford Nanopore Technologies (ONT), oferece a capacidade de sequenciar longos fragmentos de DNA, proporcionando assim uma ferramenta valiosa para resolver os segmentos intrincados e repetitivos dos genes HLA.

O protocolo detalhado para a Genotipagem Completa HLA com Sequenciação por Nanopore é o seguinte:

1. Realizar PCRs de longo alcance individuais com um kit apropriado de PCR de longo alcance utilizando 50–200 ng de DNA genómico e primers para amplificar os genes HLA de classe I. Verificar por eletroforese em gel.
2. Realizar MID-PCRs com um kit apropriado de PCR de longo alcance utilizando códigos de barras/MIDs distintos para cada reação.
3. Concentrar até 96 produtos de MID-PCR. Opcionalmente, a quantidade do produto de PCR pode ser igualizada ajustando o volume do produto de PCR concentrado com base nas intensidades das bandas na eletroforese em gel.
4. Purificar 400 μl do pool de amplicons com esferas SPRIselect numa proporção de volume de esferas/DNA de 0.6×. Certifique-se de que as esferas estão completamente suspensas. Misturar por inversão e centrifugar apenas por um curto período de tempo de modo a que as esferas permaneçam dispersas. Incubar por 5–10 min. Separar as esferas numa prateleira magnética. Descartar o sobrenadante. Realizar um passo de lavagem com 500 μl de etanol a 70%, deixando o tubo na prateleira magnética. Descartar o sobrenadante. Repetir o passo de lavagem. Centrifugar brevemente e separar o etanol no fundo do tubo das esferas usando uma prateleira magnética, e removê-lo completamente. Secar o pellet ao ar por 2 min. Eluir com 150 μl de água e centrifugar brevemente. Incubar por 5 min. Separar as esferas usando a prateleira magnética.
5. Verificar a concentração de DNA.

Preparação da Biblioteca

1. Preparar a reação de reparação das extremidades do DNA/dA-tailing de acordo com as diretrizes do fabricante.
2. Inativar a reação de reparação das extremidades do DNA/dA-tailing por calor, e centrifugar brevemente e transferir 100 μl para um tubo de 1.5 ml. Adicionar 60 μl de esferas SPRIselect (0.6×) para purificação à reação de reparação das extremidades do DNA/dA-tailing.
3. Quantificar a recuperação por fluorescência. Garantir a recuperação de 700 ng a 1 μg de DNA.
4. Misturar 22.5 μl do pool de amplicons eluídos com 2.5 μl de adaptadores 1D (kit ONT) e 25 μl de Blunt/TA Ligase Master Mix e incubar por 10 min. Usar água para alcançar um volume total de 100 μl e depois adicionar 60 μl (0.6×) de esferas SPRIselect.
5. Eluir com 46 μl de água. Incubar por 5 min. Usar a prateleira magnética para separação e transferir o sobrenadante para um tubo fresco.
6. Adicionar 5 μl de BAM (kit ONT) e 50 μl de Blunt/TA Ligase Master Mix, e incubar por 10 min.
7. Purificar adicionando 60 μl (0.6×) de esferas SPRIselect. Incubar por 5–10 min antes da separação. Descartar o sobrenadante. Lavar com 140 μl de tampão de "Ligação de Esferas de Adaptador" (kit ONT). Descartar o sobrenadante. Repetir o passo de lavagem com 140 μl de tampão de "Ligação de Esferas de Adaptador".
8. Secar o pellet ao ar por 2 min e depois eluir com 15 μl de tampão de eluição (kit ONT). Incubar por 5 min e transferir o sobrenadante para um tubo fresco após a separação.
9. Quantificar a recuperação por fluorescência. Garantir a recuperação de mais de 250 ng de DNA. A biblioteca está agora pronta para sequenciação e deve ser mantida em gelo.

Controlo de Qualidade da Célula de Fluxo, Priming e Sequenciação

1. Colocar a célula de fluxo num MinION MK1B e conectar o MinION ao computador onde o GUI MinKNOW está instalado.
2. Rotular o seu experimento no GUI MinKNOW, por exemplo, ID da amostra e ID da célula de fluxo, e pressionar o botão "Submeter". Selecionar o script de Controlo de Qualidade da Plataforma (QC) em "Escolher operação" e pressionar o botão "Executar". Quando a verificação estiver completa, o software retornará à página inicial. Para ver o relatório de poros ativos, clique no "painel de notificações". O número de poros ativos deve ser superior a 800.
3. Inspecionar a célula de fluxo em busca de bolhas de ar no canal entre a porta de priming e a matriz. Para remover bolhas de ar, abrir a "Porta de Priming" e aspirar o tampão e as bolhas; ao remover o tampão, garantir que a matriz do sensor esteja sempre coberta pelo tampão.
4. Misturar 480 μl de Buffer de Corrida (RBF) (kit ONT) com 520 μl de água. Adicionar 800 μl da solução de priming recém-preparada à "Porta de Priming". Fechar a "Porta de Priming" e esperar 5 min. Abrir a "Porta de Amostra SpotON" e adicionar 200 μl à "Porta de Priming". Não introduzir bolhas de ar ao pipetar.
5. Num tubo fresco, misturar 35 μl de Buffer de Corrida (RBF), 25.5 μl de Esferas de Carregamento, 2.5 μl de água e 12 μl da biblioteca de sequenciação. Adicionar gota a gota 75 μl desta mistura na "Porta de Amostra SpotOn". Substituir a tampa da Porta de Amostra SpotON e fechar a Porta de Priming. Fechar a tampa do MinION.
6. Selecionar o script de protocolo apropriado em "Escolher Operação" e iniciar a sequenciação pressionando o botão "Executar". O GUI manterá você atualizado sobre o progresso da sequenciação; o tempo necessário para a sequenciação depende do protocolo de sequenciação escolhido.

Extração de FASTQ e Demultiplexação

1. Criar um diretório para armazenar os arquivos FASTQ.
2. Executar albacore.
3. Baixar os scripts de demultiplexação e copiar o arquivo FASTQ recém-criado para o mesmo diretório.
4. Tornar o script wrapper executável.
5. Executar a rotina de demultiplexação.

Genotipagem

1. Abrir o NGSengine.
2. Abrir um "Novo projeto" através do botão de arquivo no canto superior esquerdo.
3. Definir um nome para o seu projeto e pressionar "Próximo".
4. Adicionar a pasta para armazenar os arquivos fastq demultiplexados e pressionar "Próximo".
5. Um resumo é mostrado, pressionar "Próximo" para ver uma visão geral dos dados para análise posterior.
6. Abrir "Preferências" através da aba de Arquivo no canto superior esquerdo:
   (a) Dentro da seção "Geral", definir o número máximo de leituras para 10.000, definir a plataforma como "Oxford Nanopore" como a plataforma de sequenciação.
   (b) Dentro da seção "Configurações padrão do Locus", definir "Amplicon" como "Auto" e "Região de Análise" como "Amplicon". Excluir trechos problemáticos, como homopolímeros, excluindo-os no campo "Ignorar regiões" após defini-lo como "Personalizado". Usar o sistema de coordenadas genómicas IPD-IMGT/HLA para definir as regiões.
   (c) Dentro da seção "Seleção de Locus", definir os loci que estavam na corrida de sequenciação. Colocá-los na coluna "Análise".
7. Definir os Loci segurando o mouse sobre a amostra a ser analisada; através do clique direito do mouse, definir o(s) locus/loci HLA que devem ser tipados.
8. Pressionar "Analisar" para todas as amostras no lado esquerdo da tela ou para uma amostra específica no lado direito no final da linha da amostra.
9. Quando a análise de dados estiver completa, uma visão geral dos alelos genotipados para as amostras será mostrada.

Conclusão

Utilizar sequenciação por nanopore para a genotipagem completa de HLA oferece uma análise robusta e meticulosa dos genes HLA. Ao gerar sequências alongadas que cobrem todo o espectro de sequências de genes, desde exões a intrões e componentes regulatórios, esta abordagem refina significativamente a precisão da tipagem HLA. Este nível de precisão é de importância primordial para facilitar a correspondência entre doadores de órgãos e medula óssea com recetores, iluminando as bases genéticas de doenças autoimunes e infecciosas, e orientando o design personalizado de intervenções terapêuticas nos domínios da imunoterapia e do avanço de vacinas.

Referência:

1. Lang K, Surendranath V, Quenzel P, et al. Genotipagem completa de HLA classe I com o sequenciador de nanopores MinION//Tipagem HLA. Humana Press, Nova Iorque, NY, 2018: 155-162.