Extração de DNA e RNA para Protocolo de Sequenciação de Metagenoma e Metatranscriptoma

Extração Simultânea de DNA e RNA de Amostras

Coextração de DNA e RNA

Para cada extração, são necessários 3 tubos Greiner de 50 mL e 4 tubos Greiner de 15 mL, que devem ser rotulados cuidadosamente.
Coloque 2 g de cada tamanho (2 e 3 mm) de esferas de vidro frescas e estéreis em cada tubo Greiner de 50 mL fresco.
3. Para preparar a mistura de extração para uma extração, misture 7,5 mL de tampão de extração com 0,2 mL de solução de SLS a 20%. Calcule sempre um adicional de uma amostra extra para as misturas mestres.
4. Prepare um tampão de fenol saturado e adicione 10 mg de 8-hidroxiquinolina por cada 10 mL de Roti®-Aqua-Fenol.
5. Utilize tesouras e pinças estéreis para cortar o sanduíche de filtro congelado em pedaços pequenos. Coloque os pedaços de filtro no tubo Greiner.
Adicione 5 mL da mistura de extração.
Adicione 5 mL de fenol saturado em tampão.
8. Vibra a mistura a 4 m/s durante 60 segundos. Centrifuga durante 20 minutos a 2000× g a 4 °C. Durante a centrifugação, a mistura separa-se numa fase fenólica inferior com esferas de vidro, uma interfase e uma fase aquosa superior.
9. Transfira a fase aquosa superior contendo o RNA para um tubo Greiner de 15 mL fresco e armazene no gelo.
Adicione 2 mL da mistura de extração e 2 mL de fenol saturado em tampão à fase fenólica para extração repetida de fenol.
11. Misture bem agitando o tubo tapado e centrifugue novamente durante 20 minutos a 2000× g a 4 °C.
12. Transfira a fase aquosa superior para a fase aquosa já coletada no passo 8. O volume das fases aquosas combinadas é de cerca de 5 mL. Armazene em gelo.
13. Para a isolação de DNA, adicione 5 mL de Tris-base à fase fenólica e misture bem. Armazene a 4 °C durante pelo menos 40 minutos, mas não mais do que 3 horas.
14. Continue com a isolação de RNA.

Isolamento de RNA

1. Adicione 0,1 volumes de acetato de sódio 3 M ao tubo Greiner que contém as fases aquosas agrupadas do procedimento de extração e separação de fases.
Adicione 5 mL de cloroformo-álcool isoamílico.
3. Misture vigorosamente por vortexação e centrifugue durante 10 minutos a 10.020× g e 4 °C para separar as fases.
4. Descongele o glicogénio (35 μg/mL) em gelo.
5. Transfira a fase aquosa para um tubo Greiner limpo e repita os passos 2 e 3.
6. Transfira a fase aquosa para um tubo Greiner limpo e adicione um volume de glicogénio de 1/700.
7. Misture vigorosamente e adicione um volume de isopropanol para precipitar o RNA.
8. Misture vigorosamente e incube as amostras a -20 °C durante a noite.
9. Continue com a isolação de DNA.

Isolamento de DNA

1. Continue com a isolamento de DNA misturando vigorosamente o tubo Greiner contendo o DNA extraído e centrifugue por 15 minutos a 2000 × g e 4 °C.
2. Transfira a fase aquosa superior para um tubo Greiner limpo.
3. Adicione 2 mL de Tris-base 1 M à fase fenólica inferior e repita a mistura e a centrifugação durante 15 minutos a 2000× g e 4 °C.
4. Transfira a fase aquosa superior para a fase aquosa já coletada no passo 2. Adicione 5 mL de cloroformo-alcool isoamílico ao tubo.
5. Misture por vortexação e centrifugue durante 20 minutos a 10.000 × g e 4 °C para separar as fases.
6. Transfira a fase superior para um tubo Greiner novo e repita os passos 4 e 5.
7. Adicione 0,1 volume de acetato de sódio 3 M e 1/700 volume de glicogénio.
8. Misture vigorosamente. Adicione 2,5 volumes de etanol puro gelado para precipitar o DNA.
9. Misture vigorosamente e incube as amostras a -20 °C durante a noite.

Lavagem e Ressuspensão de RNA e DNA

1. Pelletize os ácidos nucleicos precipitados por centrifugação a máxima g durante 30 minutos a 4 °C.
2. Lave os pellets duas vezes com 1 mL de etanol a 80% frio. Centrifugue à máxima g durante 15 minutos a 4 °C.
3. Seque o pellet durante cerca de 10 minutos à temperatura ambiente e dissolva o DNA ou RNA em 200 μL de tampão TE 1×.

Purificação de DNA e RNA

Remoção de RNA Residual de Amostras de DNA

Adicione 1 μL de RNase A ao DNA extraído.
2. Incubar a 37 °C durante 1 h.
3. Purifique o DNA utilizando o Kit de Seleção de Tamanho Gene Read.
4. Eluir DNA com 2× 25 μL de água tratada com DEPC pré-aquecida.

Purificação de RNA

1. Adicione 700 μL de tampão RLT e 7 μL de ß-ME. Misture bem.
2. Adicione 500 μL de etanol a 96–100% à RNA diluída. Misture bem. Não centrifugue. Prossiga imediatamente.
3. Transfira 700 μL da amostra para uma coluna de centrifugação RNeasy Mini colocada num tubo de coleta de 2 mL. Feche a tampa suavemente e centrifugue durante 15 s a 10,020 ×g. Descarte o fluido coletado.
4. Repita o passo 3 uma vez.
5. Coloque a coluna de centrifugação RNeasy Mini num novo tubo de coleta de 2 mL.
6. Adicione 500 μL de Buffer RPE à coluna de centrifugação.
7. Feche a tampa suavemente e centrifugue por 15 s a >10.020× g. Descarte o líquido que passou através do filtro.
Adicione 500 μL de etanol a 80% à coluna de centrifugação RNeasy Mini. Feche a tampa com cuidado e centrifugue durante 2 minutos a 10.020× g.
9. Coloque a coluna de centrifugação RNeasy Mini em um novo tubo de coleta de 2 mL. Abra a tampa da coluna de centrifugação e centrifugue a máxima velocidade durante 5 minutos. Descarte o fluido coletado e o tubo de coleta.
10. Coloque a coluna de centrifugação RNeasy Mini num novo tubo de coleta de 1,5 mL. Elua o RNA duas vezes com 50 μL de água tratada com DEPC.₂O (~95 μL de eluído) durante 1 min a velocidade máxima a 4 °C.
Misture 5 μL do RNA purificado com 5 μL de 2× RNA Loading Dye e controle o sucesso da extração e purificação do RNA correndo numa gel de agarose a 2%.

Digestão de DNA

1. Se a concentração da solução de ácido nucleico for superior a 200 ng/μL, dilua com água tratada com DEPC.
2. Adicione 1/10 do volume de 10× TURBO DNase Buffer (fornecido) à amostra de RNA.
3. Adicione 1/40 do volume de Inibidor de RNase RiboLock (concentração final de 1 U/μL).
Adicione 1 μL de TURBO DNase (2 U) por cada 10 μg de RNA.
5. Incubar a 37 °C durante 30 min.
6. Adicione 0,1 volumes de Reagente de Inativação de DNase e misture bem.
7. Incubar à temperatura ambiente durante 5 minutos. Misturar ocasionalmente.
8. Centrifugar a 10.000 × g durante 1,5 min e transferir o RNA para um tubo limpo.
9. Realize a PCR de controlo do 16S rRNA. Repita os passos 3–8 se necessário.
10. Purifique o RNA com o kit RNeasy MinElute conforme recomendado.
11. Elua o RNA em 24 μL de água tratada com DEPC.

Controlo de PCR para DNA Residual

1. Combine os seguintes ingredientes num tubo de PCR estéril e livre de DNA de 0,2 mL: 0,25 μL de tampão Phusion HF 5×, 0,5 μL de mistura de dNTP (10 mM cada), 0,75 μL de MgCl 25 mM.₂e adicione até um volume final de 24 μL com água estéril livre de RNase.₂O.
2. Adicione 1 μL de RNA tratado com DNase à mistura.
3. Realize controlos negativos utilizando a mistura de reação sem template e controlos positivos utilizando DNA de E. coli DH5alpha.
4. Utilize o seguinte esquema de ciclagem térmica: desnaturação inicial a 98 °C durante 30 s, 25 ciclos de desnaturação a 98 °C durante 10 s, anelamento a 62 °C durante 30 s, seguido de extensão a 72 °C durante 30 s. Extensão final a 72 °C durante 5 min.
5. Controle o sucesso da digestão do DNA correndo 5 μL da reação de PCR em um gel de agarose a 2%.

Síntese da Primeira e Segunda Cadeia

1. Misture 8 μL de RNA puro com 1 μL de primer reverso (20 μM) sem adaptador MiSeq do amplicon desejado, 1 μL de dNTPs (10 mM cada) e 3 μL de água estéril livre de RNase.
2. Incubar a 65 °C durante 5 min.
3. Arrefecer rapidamente no gelo durante pelo menos 1 minuto.
4. Adicione na seguinte ordem: 4 μL de tampão de reação 5×, 1 μL de DTT a 0,1 M, 1 μL de Inibidor RiboLock e 1 μL de SuperScript™ III RT (200E).
5. Vortex suavemente e colete a reação por centrifugação breve.
6. Incubar a 55 °C durante 1 h.
7. Incubar a 70 °C durante 15 min.
8. Adicione 0,5 μL de RNase H (5 U/μL).
9. Incubar durante 15 min a 37 °C.
Incubar durante 10 min a 65 °C.
11. Prossiga com a PCR do amplicão desejado utilizando 1 μL de cDNA gerado ou armazene as amostras a -20 °C até nova utilização.