Extração de DNA de Tecidos Fixados em Formalina e Incorporados em Parafina (FFPE)

Extração de DNA de tecido FFPE com Kit de Isolamento de DNA Genómico

1. Coloque de duas a cinco secções de tecido FFPE de 10 μm (com aproximadamente 1 cm² de tamanho) num tubo Eppendorf de 1,5 ml.
2. Adicione 1000 μl de xileno e agite bem durante 10 s (trabalhe num gabinete de proteção).
3. Centrifugue durante 5 min a 20.000 × g.
4. Remova cuidadosamente o sobrenadante e deite-o em contentores de resíduos específicos.
5. Adicione 1000 μl de etanol a 99%.
6. Centrifugue durante 5 min a 20.000 × g.
7. Remova cuidadosamente o etanol.
8. Adicione novamente 1000 μl de etanol a 99% e misture cuidadosamente invertendo o tubo.
9. Centrifugue durante 5 min a 20.000 × g.
10. Remova todo o etanol e deixe o tecido restante a secar ao ar, mantendo o tubo aberto, e incubar durante 10–15 min a 37 °C num bloco térmico.
11. Ressuspenda o pellet em 180 μl de Buffer ATL.
12. Adicione 20 μl de proteinase K e misture agitando.
13. Incube durante a noite a 56 °C.
14. Incube a 90 °C durante 1 h.
15. Adicione 200 μl de Buffer AL à amostra e misture bem agitando.
16. Adicione 200 μl de etanol (96–100%) e misture novamente bem agitando.
17. Continue com a extração e purificação do DNA, antes de iniciar os preparativos da amostra para a avaliação de clonalidade.

Extração de DNA de tecido FFPE começando com o Método Chelex

1. Secções de tecido desparafinizadas de 0 μm até ao passo 10.
2. Adicione 200 μl de Chelex-100 a 5% homogeneamente misturado em buffer de lise TET.
3. Incube durante 5 min a 95 °C num agitador térmico a 350 rpm.
4. Deixe arrefecer durante 5 min à temperatura ambiente.
5. Adicione 20 μl de proteinase K e incube durante a noite a 56 °C num agitador térmico a 350 rpm.
6. Incube durante 10 min a 95 °C num agitador térmico a 350 rpm.
7. Centrifugue durante 10 min a 20.000 × g à temperatura ambiente.
8. Transfira o sobrenadante para um tubo Eppendorf limpo de 1,5 ml.
9. Centrifugue durante 10 min a 20.000 × g à temperatura ambiente.
10. Transfira o sobrenadante para um tubo Eppendorf limpo de 1,5 ml.
11. Adicione 180 μl de buffer ATL (QIAamp DNA Micro Kit), agite durante 10 s e incube à temperatura ambiente durante 30 min.
12. Incube a 80 °C durante 10 min e depois deixe arrefecer à temperatura ambiente.
13. Centrifugue brevemente o tubo de 1,5 ml para remover gotas do interior da tampa.
14. Adicione 200 μl de buffer AL e agite brevemente.
15. Incube a 70 °C durante 10 min e depois deixe arrefecer à temperatura ambiente.
16. Adicione 250 μl de etanol a 96%, agite brevemente.
17. Continue o procedimento com a purificação do DNA, antes de iniciar os preparativos da amostra para a avaliação de clonalidade.

Purificação de DNA com Coluna QIAamp DNA Micro

1. Transfira cuidadosamente todo o lisado para a coluna QIAamp MinElute (num tubo de coleta de 2 ml) e centrifugue a 6000 × g durante 1 min.
2. Coloque a coluna QIAamp MinElute num tubo de coleta limpo de 2 ml e deite fora o tubo de coleta que contém o fluxo.
3. Adicione 500 μl de Buffer AW1 à coluna e centrifugue a 6000 × g durante 1 min.
4. Deite fora o fluxo e adicione 500 μl de Buffer AW2 à coluna.
5. Centrifugue a 6000 × g durante 1 min e deite fora o fluxo.
6. Centrifugue a máxima velocidade (20.000 × g) durante 3 min para secar completamente a membrana.
7. Coloque a coluna QIAamp MinElute num tubo Eppendorf limpo de 1,5 ml e deite fora o tubo de coleta que contém o fluxo.
8. Aplique 20–100 μl de Buffer ATE (QIAamp DNA FFPE Kit) ou 20–100 μl de Buffer AE (QIAamp DNA Micro Kit) no centro da membrana da coluna.
9. Incube à temperatura ambiente durante 5 min.
10. Centrifugue à máxima velocidade (20.000 × g) durante 1 min.
11. Deite fora a coluna e mantenha o tubo de 1,5 ml que contém a solução de DNA.
12. Determine a concentração de DNA e dilua, se necessário, para uma solução de trabalho de 20–40 ng/μl com o buffer de eluição utilizado ou MQ.

Referência:

1. van Bladel D A G, van der Last-Kempkes J L M, Scheijen B, et al. Detecção de clonalidade baseada em sequenciação de nova geração de rearranjos do gene da imunoglobulina em linfoma de células B[M]//Immunogenetics. Humana, Nova Iorque, NY, 2022: 7-42.