Deteção de 5-Metilcitosina (5mC) de DNA por Protocolo de Sequenciação Nanoporosa

Extração de DNA Genómico

Extração de DNA Genómico com Fenol–Cloroformio Seguido de Precipitação com Etanol

1. Homogeneizar embriões de zebrafish em 200 μL de tampão de homogeneização e incubar a amostra a 55℃ por não mais de 2 h. Inverter o tubo várias vezes para garantir que os embriões estão homogenizados após a incubação.
2. Para remover a contaminação por RNA, incube a amostra a 95℃ durante 10 minutos. Adicione 1 μL de RNase A por 100 μL de DNA genómico homogeneizado e incube à temperatura ambiente durante 30 minutos.
3. Realize duas extrações de fenol–clorofórmio em amostras. Adicione fenol–clorofórmio–álcool isoamílico à amostra na proporção de 1:1 (aproximadamente 200 μL). Inverta o tubo várias vezes para misturar as soluções. Centrifugue durante 5 minutos a 13.000 rpm (16.000 rcf).
4. Remova aproximadamente 180 μL da camada aquosa superior das soluções misturadas e transfira para um novo tubo Eppendorf, tendo cuidado para não remover nenhuma solução da fase de fenol–clorofórmio–álcool isoamílico. Repita a extração com fenol–clorofórmio na camada aquosa separada.
5. Adicione 1/10 do volume de acetato de sódio 3 M (pH 5.2), 2,5 volumes de etanol absoluto frio e 2 μL de acrilamida linear ao DNA genómico. Precipite a -80℃ durante 30 min a 1 h ou a -20℃ durante pelo menos 1 h. Períodos de precipitação prolongados (como durante a noite) podem aumentar a recuperação.
6. Após a precipitação, centrifugar as amostras à velocidade máxima durante 5 minutos. Remover o sobrenadante e lavar o pellet em 500 μL de etanol a 70% frio. Centrifugar as amostras à velocidade máxima durante 5 minutos. Remover o sobrenadante.
7. Ressuspenda o pellet em água livre de nucleases ou em tampão de eluição até ao volume desejado. Armazene a -20 ℃.

Controlo de Qualidade

1. Utilize um ensaio fluorométrico sensível de acordo com as instruções do fabricante para quantificar com precisão a quantidade de DNA genómico presente na sua amostra. Deve haver pelo menos 1 μg de gDNA na sua amostra. Utilize o espectrofotómetro NanoDrop 2000 para determinar a pureza da amostra de gDNA. Os seguintes parâmetros devem ser cumpridos ao sequenciar uma amostra.
2. Execute gDNA numa TapeStation utilizando os reagentes de Análise de ScreenTape de DNA Genómico para determinar a distribuição de tamanhos dos fragmentos de DNA. Se estiverem presentes fragmentos de DNA com menos de 1 kb, prossiga para o passo 3. Se os fragmentos de DNA forem maiores do que pelo menos 1 kb, prossiga para a Preparação da Biblioteca e Sequenciação.
3. Fragmentos de ADN com menos de 1 kb podem ser removidos de acordo com as instruções do fabricante. Este protocolo realiza uma quase completa depleção de fragmentos com menos de 5 kb e uma depleção progressiva de fragmentos com menos de 10 kb. A eficiência de recuperação é de aproximadamente 50–90% do ADN de entrada. Para garantir que a amostra cumpre todos os requisitos para a seleção de tamanho, repita todos os passos de controlo de qualidade detalhados em Controlo de Qualidade após a seleção de tamanho.

Preparação de Biblioteca e Sequenciação

A preparação da biblioteca e a sequenciação são realizadas utilizando o Kit de Sequenciação por Ligação de acordo com as instruções do fabricante. Alternativamente, a preparação da biblioteca e a sequenciação podem ser realizadas numa instalação que oferece serviços de sequenciação Nanopore.

Referência:

1. Angeloni A, Ferguson J, Bogdanovic O. Sequenciação por Nanoporos e Análise de Dados para Perfilagem de 5-Metilcitosina em Todo o Genoma com Resolução de Base[M]//Chromatina. Humana, Nova Iorque, NY, 2022: 75-94.