Protocolo de Sequenciação de Triagem CRISPR

Isolamento de DNA Genómico

1. Limpe a estação de DNA genómico com 10% de lixívia, seguida de água e, finalmente, 70% de etanol. Prepare alíquotas das quantidades necessárias das soluções do Kit de Purificação de DNA Genómico Wizard. Aqueça o tampão TE (Solução de Reidratação) a 65 °C e prepare 70% de etanol (para amostras) utilizando água UltraPure.
2. Descongele os pellets celulares à temperatura ambiente durante 5–10 minutos.
3. Ressuspenda as células em 1 ml de PBS e transfira para um tubo de centrífuga de 50 ml. Lave o tubo original com 400 μl de PBS e adicione ao mesmo tubo de 50 ml.
Adicione 5 ml de Solução de Lise de Núcleos às células ressuspendidas. Misture pipetando com uma pipeta de 10 ml (cinco vezes).
5. Adicione 32 μl de RNase A (estoque a 20 mg/ml; concentração final de 100 μg/ml) ao lisado nuclear e misture invertendo o tubo cinco vezes. Incube a 37 °C durante 15 minutos e depois deixe arrefecer à temperatura ambiente (~10 minutos).
Adicione 1670 μl de Solução de Precipitação de Proteínas ao lisado nuclear e agite vigorosamente durante 20 s.
7. Centrifugar a 4500 × g durante 10 min à temperatura ambiente.
8. Usando uma pipeta de 10 ml, transfira o sobrenadante para um tubo de centrífuga de 50 ml contendo 5 ml de isopropanol. Tenha muito cuidado para não transferir nenhum precipitado.
9. Misture suavemente a solução dez vezes por inversão, até que os fios brancos semelhantes a fios de DNA formem uma massa visível.
10. Centrifugar a 4500 × g durante 5 minutos à temperatura ambiente. O DNA será visível como um pequeno pellet branco.
11. Remova cuidadosamente o sobrenadante, evitando deslocar o pellet. Adicione 5 ml de etanol a 70% ao DNA. Gire suavemente o tubo para lavar o pellet de DNA e as paredes do tubo de centrifugação.
Centrifugar a 4500 × g durante 5 minutos à temperatura ambiente.
13. Remova cuidadosamente e completamente todo o etanol, evitando deslocar o pellet. Deixe o ADN genómico secar ao ar à temperatura ambiente durante 10–30 minutos até que o pellet fique translúcido. Não deixe secar em demasia (antes de aparecerem fissuras visíveis). Evite a contaminação por partículas de poeira.
14. Adicione 400μl de tampão TE (Solução de Reidratação de DNA) e deixe o DNA dissolver incubando a 65 °C durante 1–4 h. Misture o DNA dando ligeiros toques no tubo a cada 15 min até que o pellet esteja completamente dissolvido. A suspensão pode ser ligeiramente viscosa, mas não deve conter aglomerados de DNA.
Centrifugar a 4500 × g durante 1 minuto à temperatura ambiente e transferir o DNA genómico para um tubo de 1,5 ml de baixa ligação.
16. Quantifique o DNA utilizando um fluorómetro Qubit e armazene a −20 °C.

Preparação da Biblioteca de Sequenciamento

1. Inclua sempre a amostra T0 para determinar a representação da biblioteca no rastreio e permitir o cálculo da variação do gRNA.
2. Limpe as estações de trabalho PCR1 e PCR2 com 10% de lixívia, seguido de água e, por fim, 70% de etanol.
3. Prepare um gel de agarose a 1% contendo o corante SYBR Safe DNA para verificar os produtos amplificados do PCR1. O PCR1 enriquece a cassete de gRNA do genoma.
4. Na capela de PCR: prepare uma reação de diagnóstico (não adicione ainda o DNA genómico) e um controlo negativo sem template.
5. Verifique a amplificação da PCR correndo 2μl do produto da PCR no gel de agarose preparado. O tamanho esperado do produto é de aproximadamente 600 bp.
6. Amplifique as reações PCR1 num termociclador utilizando o programa.
7. Dirija-se à estação de trabalho PCR2 e junte todas as 14 + 1 reações PCR1 (diagnóstica) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
8. Mergulhe o equipamento de gel de agarose (bandeja de gel, pente e tanque de gel) para purificar os produtos amplificados de PCR2 com HCl 0,1 N durante 10 minutos antes de preparar o gel. Enxague 4 vezes com água da torneira e uma vez com água purificada.
9. Prepare um gel de agarose a 2% contendo corante SYBR Safe para purificar os produtos amplificados do PCR2. Use pentes grandes e deixe bastante espaço entre as amostras. O PCR2 amplifica a cassete gRNA e adiciona adaptadores Illumina TruSeq com índices i5 e i7.
10. Prepare reações PCR2 (não adicione ainda o produto do PCR1 como template). Prepare controles sem template conforme desejado.
11. Execute a reação completa de PCR2 no gel de agarose a 2% preparado a baixa voltagem (execução de 1,5 a 2 horas). Visualize o produto de PCR num transiluminador de luz azul, o tamanho esperado do produto é de aproximadamente 200 bp. Podem ser visíveis várias bandas; é importante separar bem as bandas.
12. Corte a banda de 200 bp com uma nova lâmina de barbear e transfira a fatia de gel para um tubo de 1,5 ml.
13. Purifique o DNA de uma fatia de gel de agarose utilizando um kit de extração de gel. Recomendamos repetir cada etapa de ligação duas vezes e incluir lavagens intermédias com o tampão de ligação se os volumes de ligação forem grandes. Também recomendamos uma eluição dupla para maximizar o rendimento.
14. Armazene o DNA purificado por gel num tubo de baixa adesão de 1,5 ml.
15. Quantificar DNA no fluorómetro Qubit.

Sequenciação de Nova Geração

1. Devido a diferenças nos requisitos de submissão de amostras e nos controlos de qualidade aplicados por instalações e fornecedores de sequenciação de nova geração, apenas fornecemos recomendações gerais nesta secção.
2. As bibliotecas de sequenciação podem agora ser agrupadas. O grau de multiplexação depende da profundidade de leitura desejada por amostra. Para rastreios de dropout, recomendamos ler cada amostra com uma cobertura de biblioteca de 200 vezes e 500 vezes para amostras T0, para garantir robustez durante a análise de dados devido à ausência de réplicas independentes em T0. Para rastreios de seleção positiva forte que visam a identificação de gRNAs enriquecidos, uma cobertura de 50 vezes pode ser suficiente.
3. Sequenciação em Illumina HiSeq2500 ou NextSeq550 com primers standard para indexação dupla.

Referência:

1. Mair B, Aregger M, Tong A H Y, et al. Um Método para Mapear a Essencialidade de Genes em Células-Tronco Pluripotentes Humanas através de Ecrãs CRISPR em Escala Genómica com Cas9 Induzível[J]. Genes e Genomas Essenciais: Métodos e Protocolos, 2022: 1-27.