Protocolo de Identificação do Coronavírus por Sequenciação Metagenómica

Preparação da Amostra

1. Juntar os conteúdos intestinais de pintos de codorniz infectados experimentalmente e ressuspender em 500 μl de PBS com penicilina e estreptomicina. Vortex.
2. Filtrar (filtro de 0,45 μm) a solução para eliminar partículas do tamanho de células eucarióticas e bacterianas.
3. Centrifugar o conteúdo digestivo a 10.000 × g durante 30 min, duas vezes, para clarificar a solução e coletar o sobrenadante em um novo tubo.

Concentração de Partículas Virais

1. Pelotar o material concentrado por ultracentrifugação a 100.000 × g durante 2 h.
2. Tratar com RNAse e DNAse para remover ácidos nucleicos não protegidos por partículas: fazer uma mistura de 500 μl de amostra, 10 μl de DNAse (100 U), 12 μl de RNAse (20 μg/μl), 60 μl de tampão de DNAse 10×, 16 μl de PBS. Incubar a mistura durante 20 min a 37 °C e depois 10 min a 75 °C para parar a reação.

Extração e Amplificação de RNA

1. Adicionar 750 μl de TRIzol a 250 μl de amostra, passo 2, e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
2. Adicionar 200 μl de cloroformio, vortexar vigorosamente e incubar durante 10 min à temperatura ambiente.
3. Centrifugar durante 15 min a 11.000 × g a 4 °C.
4. Coletar a fase aquosa superior.
5. Extrair RNA de 150 μl da fase aquosa coletada em uma coluna de silicato com um kit de extração de RNA.
6. Realizar uma reação de transcrição reversa usando primers aleatórios, misturando 7,5 μl de RNA, 5 μl de hexâmero aleatório marcado.
7. Incubar a 65 °C durante 5 min e depois manter em gelo.
8. Adicionar 4 μl de tampão de reação 5×, 0,5 μl de inibidor de RNase, 2 μl de dNTP e 1 μl de transcriptase reversa RevertAid.
9. Incubar a 25 °C durante 10 min, a 42 °C durante 60 min e a 70 °C durante 10 min.
10. As reações podem agora ser armazenadas a −20 °C ou usadas imediatamente para PCR.
11. Realizar uma PCR aleatória misturando 10 μl de tampão de reação Phusion HF 5×, 1 μl de dNTP, 0,5 μl de primer apenas marcado, 5 μl de cDNA, 0,5 μl de polimerase Phusion e 33 μl de água.
12. Realizar PCR usando o seguinte ciclo: 98 °C durante 30 s seguido por 40 ciclos de 98 °C durante 10 s, 65 °C durante 20 s e 72 °C durante 30 s, seguido por uma incubação final a 72 °C durante 10 min.
13. Analisar os produtos da PCR em um gel de agarose a 1 %, migrar durante 1 h a 60 V.
14. Excisar as bandas de 300 bp e realizar uma purificação em gel com um kit comercial.
15. Avaliação da qualidade da biblioteca preparada: quantificar o DNA gerado por um método baseado em fluorescência (ensaio de quantificação PicoGreen®) e almejar 1 μg de DNA como entrada; verificar a qualidade do DNA e almejar uma razão 260:280 >1,8.

Geração de Clusters Usando o Kit de Reagentes Miseq (Illumina)

1. Hibridizar a amostra na célula de fluxo.
2. Amplificar a amostra (amplificação em ponte).
3. Linearizar fragmentos.
4. Bloquear fragmentos.
5. Hibridizar o primer de sequenciamento.

Sequenciamento no Miseq (Illumina)

1. O fragmento de DNA da biblioteca atua como um molde, a partir do qual uma fita complementar é sintetizada.
2. ddNTPs são adicionados um a um (um ciclo = um ddNTP adicionado, uma imagem capturada e desfluoração do ddNTP para poder adicionar um novo ddNTP no ciclo seguinte) por uma DNA polimerase. A adição de ddNTP é registrada digitalmente como dados de sequência ciclo após ciclo.

Análise de Dados

1. Pré-processar os dados para remover sequências de adaptadores e desmultiplexação usando splitbc (várias amostras podem ser multiplexadas e executadas juntas no sequenciador MiSeq Illumina para reduzir custos).
2. Pré-processar os dados para remover leituras de baixa qualidade e compilar sequências pareadas usando illuminapairedend.
3. Mapear os dados para um genoma de referência ou alinhar de novo as leituras de sequência (alinhamento com bwa, consenso computado com o pacote de software SAMtools. Exibir os resultados com o navegador IGV).
4. Analisar a sequência compilada com o software GAAS com um valor esperado de 10−3.