Protocolo de Sequenciação por Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP-seq)

Preparação de Suspensão Celular e Lisado de Tecido

Trypsinize as células aderentes cultivadas e suspenda-as em PBS. Alternativamente, as células podem ser raspadas do prato de cultura após a fixação. Normalmente, utilizam-se 10⁶–10⁷ células para uma única IP; no entanto, o número óptimo de células varia dependendo do anticorpo utilizado. Para preparar lisados de tecido, congele rapidamente seções de tecido isoladas recentemente (30–100 mg) em azoto líquido e, em seguida, homogeneize-as em PBS usando um homogeneizador Dounce (1–2 mL) com um pistão solto.

Fixação e Fragmentação da Cromatina

Modificações de Histonas

1. Adicione 1/10 do volume de tampão de fixação à suspensão celular ou lisado de tecido e incubar a 25℃ durante 5–15 min com agitação ou rotação suave.
2. Adicione 1/10 do volume de 1,5 M glicina e incubar a 25℃ durante 3 min com agitação ou rotação suave.
3. Centrifugue e lave duas vezes com PBS.
4. Ressuspenda o pellet celular em tampão de lise e incubar no gelo durante 15 min. Homogeneize as células dez vezes com uma seringa equipada com uma agulha 21–23G. Conte os núcleos usando um hemocitómetro ou pela coloração com DAPI. Centrifugue os núcleos durante 5 min a 4℃.
5. Ressuspenda o pellet em tampão de lise SD a uma densidade de 1–2×10⁶ núcleos/100μL e incubar no gelo durante 5 min.
6. Transfira a suspensão de núcleos para um tubo Picoruptor (100–300 μL/tubo). Condição de sonicação: 5–30 ciclos (30 seg ligado/30 seg desligado) a 4℃.
7. Centrifugue a mistura a 13.000 ×g durante 5 min, a 4℃, e colete o sobrenadante para os passos subsequentes de IP.

Modificadores de Histonas

1. Dupla ligação cruzada: Antes da ligação cruzada com formaldeído, suspenda as células/lisado de tecido em 2 mM DSG e incubar a 25℃ durante 5 min.
2. Sonicação: Suspenda os núcleos em tampão 1×RIPA, que contém 0,1% SDS, em vez de tampão de lise SDS. O tempo óptimo de sonicação pode ser mais longo (até 50 min) do que o método de ligação cruzada única.

Imuno-precipitação

1. Pré-limpeza: Dilua a solução de cromatina fragmentada dez vezes com tampão de diluição ChIP. Adicione Dynabeads Proteína A ou G a 20μL/mL e gire a 4℃ durante 1h. Coloque o tubo em um suporte magnético durante 5 min e colete o sobrenadante. Neste ponto, a cromatina de 1–4×10⁶ células será solubilizada por 1mL.
2. Anticorpos: Mantenha 10% da amostra de entrada para a purificação subsequente de DNA. Adicione anticorpos específicos para a modificação ou modificador de histona a 4–10 μg/mL. Uma amostra paralela adicionando uma quantidade equivalente de IgG de controle deve ser preparada. Gire durante a noite a 4℃.
3. Captura com beads: Adicione 20 μL de Dynabeads Proteína A ou G e gire a 4℃ durante 2–3h.
4. Os beads devem ser lavados cinco vezes com tampão RIPA (baixo sal), tampão RIPA (alto sal) e tampão LiCl e duas vezes com TE. Entre cada lavagem, misture por rotação durante 3–5 min, centrifugue e coloque em um suporte magnético.
5. Desligação cruzada reversa: Suspenda os beads em 200 μL de tampão de eluição direta. Para as amostras de entrada, adicione tampão de diluição ChIP para fazer o volume total de 192 μL e, em seguida, adicione 8 μL de NaCl 5M. Incube a 65℃ durante pelo menos 4h.

Purificação de DNA

1. Adicione 1 μL de RNase A e incubar a 37℃ durante 30 min.
2. Adicione 1 μL de Proteinase K e incubar a 4℃ durante 1 h.
3. Adicione um volume igual de PCI, vortexe e centrifugue a 13.000 ×g durante 5 min. Colete a fase aquosa. Para a extração de volta, adicione TE/NaCl ao tubo original e repita a extração (a fase aquosa combinada somará aproximadamente 400 μL).
4. Adicione 1 μL de glicogénio e 900 μL de etanol 100%. Vortexe e incubar a -20℃ durante 5 min. Centrifugue a 13.000 ×g durante 5 min e descarte o sobrenadante. Lave o pellet com etanol a 70–80%.
5. Suspenda o DNA pelotado em 50–100 μL de TE.

Preparação de Biblioteca NGS

1. Antes da preparação da biblioteca, analise a distribuição de tamanhos dos fragmentos de DNA usando um TapeStation ou um instrumento Bioanalyzer. Se nenhum dos dois estiver disponível, realize eletroforese em gel de agarose combinada com coloração SYBR Gold, que melhora a deteção de DNA em baixa concentração.
2. Para a preparação da biblioteca, utilize um kit apropriado de preparação de biblioteca de DNA de acordo com as instruções do fabricante. Utilizamos 20–30 ng de DNA IP ou 50–100 ng de DNA de entrada para cada biblioteca. Para a amplificação da biblioteca, geralmente utilizam-se 10–15 ciclos de PCR.
3. É importante confirmar que as distribuições de tamanhos são equivalentes entre as bibliotecas geradas. A quantidade de DNA da biblioteca deve ser quantificada usando um método baseado em qPCR. O Kit de Quantificação de Biblioteca Gen-Next NGS pode ser utilizado.

Referência:

1. Pei J, van den Dungen N A M, Asselbergs F W, et al. Protocolo de Sequenciação por Imuno-precipitação de Cromatina (ChIP-seq) para Pequenas Quantidades de Tecido Cardíaco Congelado Biobancado[M]//Cromatina. Humana, Nova Iorque, NY, 2022: 97-111.