Protocolo de Preparação de Amostras ChIP-Seq

Colheita de Material e Ligação Cruzada

1. Tecido animal: Transfira o tecido fresco ou congelado rapidamente (5–30 mg) para um tubo estéril de 1,5 mL e adicione um pequeno volume de PBS gelado + inibidores de protease (250 μL a 1,5 mL ao começar com 5 mg e 30 mg de tecido, respetivamente) para desagregar o tecido com um homogeneizador de tecido. Não deixe o volume exceder 1,2 mL; se isso ocorrer, divida a amostra em dois tubos.
2. Complete o volume do tecido homogeneizado com PBS frio + inibidores de protease (1–6 mL, aumentar proporcionalmente à quantidade inicial de tecido) e transfira para um tubo de 15 mL frio.
3. Células em suspensão: Comece com 10^sete células (máximo de 5 × 10)^sete células) que são centrifugadas e resuspendê-las em 10 mL de PBS gelado.
4. Células aderentes: Tentezinize e colete as células (10⁷ células, até 5 × 10⁷ células) por centrifugação, remover o sobrenadante e adicionar 10 mL de PBS frio.
5. Para a ligação cruzada simples: Adicione formaldeído até uma concentração final de 1% e imediatamente incube as amostras sob rotação suave durante 10 minutos, à temperatura ambiente.
6. Neutralize a reação adicionando glicina até uma concentração final de 150 mM e incubar as amostras sob rotação suave durante 5 minutos, à temperatura ambiente.
7. Para a dupla ligação cruzada: Adicione EGS (etileno glicol bis(succinimidil succinato)) a uma concentração final de 1,5 mM e coloque as amostras sob rotação suave durante 30 minutos à temperatura ambiente.
8. Adicione formaldeído até uma concentração final de 1% e incube com rotação suave durante 10 minutos à temperatura ambiente.
9. Neutralize a reação adicionando glicina até uma concentração final de 150 mM e incubar as amostras a girar suavemente durante 5 minutos, à temperatura ambiente.
10. Colha o tecido ou as células por centrifugação a 2000×g durante 10 min a 4 °C.
11. Remova o sobrenadante e adicione um volume igual de PBS frio. Agite o tubo até soltar o pellet celular.
12. Colha o tecido ou as células por centrifugação a 2000×g durante 10 min a 4 °C. Neste ponto, as amostras podem ser congeladas rapidamente em azoto líquido e armazenadas a -80 °C durante até um mês. Descongele sempre as amostras de tecido sobre gelo (pode demorar algumas horas se os pellets forem grandes).

Isolamento de Cromatina e Sonicação

1. Resuspenda o pellet em tampão de lise celular. Para um pellet pequeno (10⁷ células ou 5 mg de tecidos geram um pellet que é menor que 50 μL—use os marcadores no tubo de 1,5 mL como referência), adicione 1 mL de tampão de lise celular. Para pellets maiores, adicione 5 mL de tampão de lise celular e pipete para cima e para baixo até que o pellet esteja completamente dissolvido.
2. Incubar em gelo durante 10 min.
3. Ao lisar tecidos: transfira a suspensão do tecido para um homogeneizador Dounce de 2 mL (mantido em gelo) e complete a destruição do tecido com o pistilo B (20 golpes). Transfira o lisado para um tubo novo de 1,5 mL ou 15 mL (de acordo com o volume do tampão de lise celular utilizado no passo 6). Lave o homogeneizador com 50 μL de tampão de lise celular e combine os dois volumes.
4. Centrifugar o lisado a 2000×g durante 5 min a 4 °C.
5. Remova o sobrenadante e adicione o tampão de lise nuclear. Para pellets pequenos, adicione 500 μL de tampão, e para pellets maiores, adicione até 3 mL de tampão de lise nuclear. Incube em gelo durante 10 minutos.
6. Reserve uma alíquota (10–15 μL) da solução de cromatina e mantenha em gelo. Esta será utilizada como controlo não sonicado, que será comparado com a cromatina sonicada para verificar a eficiência da sonicação.
7. Sonifique as suas amostras. Como a sonicação depende do tipo celular, da composição do tecido e do modelo do sonificador, este passo requer otimização. Ao utilizar um sonificador Covaris E220 com tubos de fibra AFA de 1 mL (até 1,2 × 10⁷ células), recomendamos as seguintes definições como ponto de partida: (PIP = 75, Fator de trabalho = 2%, CPB = 200, tempo = 1 a 5 min).
8. Pipetar dois alíquotas (10–15 μL) das amostras sonificadas, uma para determinar a eficiência da sonificação e outra para quantificação de DNA. Manter as amostras em gelo.
9. Centrifugar as amostras a 18.000×g durante 10 min a 4 °C para remover os detritos. Transferir o sobrenadante para um tubo fresco de 1,5 mL e manter em gelo. Neste ponto, a cromatina pode ser congelada rapidamente em azoto líquido e armazenada a -80 °C por até um mês. Sempre descongelar a cromatina em gelo, conforme descrito acima.
Adicione 10 μg de RNAse A a todos os alíquotas reservados e incubar durante 30 min a 37 °C.
Adicione 20 μg de proteinase K a todos os alíquotas reservadas e incubar durante 1 h a 65 °C.
12. Ferva os alíquotas durante 10 minutos a 95 °C para reverter as ligações cruzadas e deixe as amostras arrefecer até à temperatura ambiente.
13. Para verificar a eficiência da sonicação de DNA, analise o tamanho dos fragmentos de DNA em um gel de agarose a 1%. Se as amostras forem submetidas a NGS, o tamanho dos fragmentos deve variar entre 200 e 500 pb. Se o método de análise for qPCR, os fragmentos devem variar entre 500 e 1000 pb.
14. Quantifique a alíquota reservada para a quantificação de DNA, utilizando o QIAquick PCR Purification Kit. O DNA eluído pode ser quantificado num espectrofotómetro NanoDrop.