Protocolo de Extração de cfDNA e Controlo de Qualidade

O DNA extracelular livre (cfDNA) é DNA fragmentado que é libertado de células apoptóticas e necróticas em pequenos fragmentos de <200 bp. O DNA livre de células é tipicamente isolado da corrente sanguínea; no entanto, também é possível detetar cfDNA em outros fluidos biológicos, como urina ou líquido cefalorraquidiano. Foi encontrado que o ctDNA de pacientes com câncer transporta informação genética das células tumorais. Assim, o estudo do DNA circulante ajuda a resolver mutações genómicas em doenças específicas, como vários tipos de câncer. Pode ser utilizado no futuro para biópsias não invasivas e monitorização da doença residual mínima (MRD).

Preparação de Amostras

1. Centrifugar os tubos de coleta de sangue a 2000 × g durante 10 min. Se estiver a usar tubos de EDTA, o tempo de processamento não deve ultrapassar 4 h após a colheita da amostra.
2. Mova cuidadosamente os sobrenadantes (plasma) para um tubo de 5 ml com fundo cónico, sem danificar a fase do manto leucocitário.
3. Centrifugar o plasma isolado a 16.000 × g, a 4°C durante 10 min.
4. Transfira os sobrenadantes para um tubo limpo de 5 ml. Prossiga imediatamente para a extração de cfDNA ou armazene a -80°C.
5. O cfDNA deve ser extraído de 4 ml de plasma sanguíneo purificado (ajustar as amostras para 4 ml adicionando solução salina tamponada com fosfato se o volume for inferior a 4 ml).

Extração de cfDNA

1. Antes de iniciar a extração, o seguinte deve ser feito:
(a) Equilibre as amostras e os tampões à temperatura ambiente (18–25°C).
(b) Aqueça um banho-maria ou bloco de aquecimento a 60°C para uso com tubos de 50 ml.
(c) Aqueça um bloco de aquecimento a 56°C para uso com tubos Eppendorf de 2 ml.
2. Pipetar 400 μl de Proteinase K para um tubo de 50 ml previamente rotulado.
Adicione 4 ml de plasma ao tubo.
4. Adicione 3,2 ml de tampão ACL ao tubo. Misture bem por vortexação durante 30 segundos.
5. Incubar durante 30 min a 60°C.
6. Adicione 7,2 ml do tampão ACB e misture bem por vortexação durante 15–30 s.
7. Incube a mistura durante 5 minutos em gelo.
8. Insira um extensor de tubo de 20 ml na coluna aberta. Certifique-se de que o extensor de tubo está firmemente inserido na coluna para evitar o vazamento da amostra.
9. Despeje cuidadosamente a mistura do passo 6 no extensor do tubo. Ajuste a bomba de vácuo para produzir um vácuo de -800 mbar a -900 mbar até que todos os lisados sejam aspirados (pode levar até 15 minutos).
10. Libere a pressão para 0 mbar, descarte os extensores de tubo com cuidado e mantenha as colunas ligadas ao VacConnector no QIAvac 24 Plus.
11. Adicione 600 μl de tampão de lavagem ACW1 à coluna. Ligue a bomba de vácuo (-800 mbar a -900 mbar) enquanto a tampa está aberta. Após todo o tampão de lavagem ter passado pela coluna, desligue a bomba de vácuo e liberte a pressão para 0 mbar.
12. Adicione 750 μl de tampão de lavagem ACW2 à coluna. Ligue a bomba de vácuo (-800 mbar a -900 mbar) enquanto a tampa estiver aberta. Após todo o tampão de lavagem ter passado pela coluna, desligue a bomba de vácuo e liberte a pressão para 0 mbar.
13. Adicione 750 μl de etanol (96–100%) à coluna. Ligue a bomba de vácuo (-800 mbar a -900 mbar) enquanto a tampa está aberta. Após todo o tampão de lavagem ter passado pela coluna, desligue a bomba de vácuo e liberte a pressão para 0 mbar.
14. Feche a tampa da coluna. Remova-a do manifold de vácuo e descarte o VacConnector. Transfira a coluna para um tubo de coleta limpo de 2 ml e centrifugue a máxima velocidade (16.000 × g) durante 3 min.
15. Mova a coluna QIAamp Mini para um novo tubo de coleta de 2 ml, abra a tampa e incube a 56°C durante 10 minutos para secar completamente a membrana.
16. Mova a coluna QIAamp Mini para um tubo de eluição limpo de 1,5 ml. Com cuidado, adicione 20–150 μl do Buffer AVE sobre o filtro da coluna QIAamp Mini. Feche a tampa e incubar à temperatura ambiente durante 3 minutos.
17. Centrifugar durante 1 min a 16.000 × g. Descartar colunas.
18. Para o processamento posterior, o cfDNA isolado pode ser armazenado a 4°C durante até 24 horas. Para armazenamento prolongado, congele a <30°C.
19. Utilize um analisador de fragmentos para dimensionar e qualificar com precisão o cfDNA extraído.
Após a extração, o cfDNA deve ser armazenado a -80 °C.

Controlo de Qualidade de cfDNA por PCR Digital em Gota (ddPCR)

1. Prepare a mistura de reação adicionando 10 μl de Supermix ddPCR 2×, 0,3 μl de primer forward (20 μM), 0,3 μl de primer reverse (20 μM) e 0,1 μl de sonda (20 μM) a 1 μl de DNA e complete com ddH2O até 20 μl.
2. Gere as gotas pipetando 20 μl de amostra nos poços de amostra e 70 μl de óleo para geração de gotas QX200 no poço de óleo no cartucho DG8, cubra com as gaxetas DG8 e coloque no gerador de gotas QX200.
3. Transfira cuidadosamente 40 μl das gotas geradas para a placa de PCR Twin. tec, pipetando lentamente com uma pipeta multicanal. Feche a placa utilizando um selante de calor de folha perfurável e um selador de placas de PCR PX1™.
4. Realize a reação de PCR num termociclador, incubando a amostra durante 10 min a 95°C para desnaturação, seguida de 40 ciclos de 30 s de incubação a 94°C para desnaturação inicial e 1 min de incubação a 60°C para anelamento. Aplique um passo final de extensão, incubando durante 10 min a 98°C e armazene a amostra a 4°C.
5. Mova as placas para o Leitor de Gotículas QX200 para medir as Gotículas amplificadas.
6. Para medir os fragmentos amplificados, inicie um novo experimento no Software QuantaLife™, ajuste o Supermix para ddPCR™ Supermix sem dUTP para os poços desejados, nomeie os alvos e selecione os canais apropriados conforme utilizado na sonda (FAM, HEX, etc.).
7. Coloque a placa no leitor e execute o experimento, escolha o DyeSet: FAM ou FAM/HEX.
8. Guarde a análise e carregue o ficheiro exportado no software Quanta-Soft™ Pro.
9. Defina o limiar na Amplitude 1D para a fração positiva.
10. Exporte os resultados para o Excel ou qualquer outra aplicação de folhas de cálculo.
11. Calcule a média das leituras de cópias/20 μl e divida por 2 para determinar o número de cópias/célula.
12. Divida o número de cópias/célula por 150 para calcular a concentração (ng/μl). Calcule a concentração de cfDNA por 1 ml de plasma.
13. Para a preparação da biblioteca, mantenha os reagentes em gelo até à utilização.

Referências:

1. Pott C, Kotrova M, Darzentas N, et al. Análise de IG baseada em cfDNA por NGS em Linfoma[M]//Imunogenética. Humana, Nova Iorque, NY, 2022: 101-117.
2. Bohers E, Viailly P J, Jardin F. Sequenciação de cfDNA: abordagens tecnológicas e questões bioinformáticas. Pharmaceuticals, 2021, 14(6): 596.