Protocolo ATAC-Seq

Congelação de Tecidos

Congelação Rápida

1. Colete o tecido em um criovial estéril.
2. Mergulhe o criovial contendo o tecido em nitrogênio líquido.
3. Armazene o frasco em um tanque de armazenamento de nitrogênio líquido ou em um congelador a -80℃ para armazenamento a longo prazo.

Incorporação e Congelação em OCT

1. Antes de congelar o tecido, organize os criomoldes e rotule-os com um marcador.
2. Mantenha o OCT à temperatura ambiente.
3. Coloque várias gotas de OCT no criomolde de plástico. Coloque o tecido em cima, mantendo a orientação correta para o corte. Despeje cuidadosamente o OCT sobre o tecido, evitando bolhas até que nenhum tecido permaneça exposto. Segure o criomolde mantendo-o na posição vertical usando pinças e introduza-o dentro do nitrogênio líquido até que o bloco esteja congelado. Os blocos de tecido devem ser armazenados a -80℃.

Corte de Tecidos

1. Para a análise histológica, corte uma seção de criostato com 5–10 μm de espessura e monte-a em um Slide Superfrost Plus. Colore os slides com hematoxilina-eosina (H&E) para exame histológico seguindo métodos padrão. O tecido pode ser macrodissecado usando uma lâmina estéril, se necessário.
2. Para isolamento de núcleos, corte 1–2 seções (50 μm) e introduza-as em um tubo de 1,5 mL pré-resfriado.
3. Adicione 1 mL de PBS frio (1×) para remover o OCT.
4. Centrifugue a 1500 ×g por 1 min a 4℃ e descarte o sobrenadante.
5. Repita os passos 1 e 2 até que o OCT seja completamente eliminado.

Homogeneização de Tecidos e Lise Celular

1. Após a remoção do OCT, ressuspenda a seção de tecido ou o tecido congelado rapidamente em 300 μL de tampão de lise frio e dounce o tecido até a homogeneização completa usando pilões descartáveis em microtubos de 1,5 mL.
2. Incube os tubos por 10 min em gelo.
3. Adicione 1 mL de tampão de lavagem.
4. Passe o tecido homogeneizado por um filtro celular de 40 μm. O fluxo deve conter os núcleos.
5. Centrifugue os núcleos a 800 ×g por 10 min a 4℃ e remova o sobrenadante.
6. Lave os núcleos com 300 μL de tampão de lavagem.
7. Repita os passos 5 e 6 um total de 2 vezes.
8. Descarte o sobrenadante e ressuspenda em 300 μL de tampão de lavagem.
9. Conte e visualize os núcleos com o Contador de Células Automatizado Countess® II FL, contracolorido com o reagente DAPI. Alternativamente, os núcleos podem ser contados usando um hemocitômetro.
10. Se a preparação dos núcleos ainda tiver detritos e não estiver limpa o suficiente, repita os passos 4–7.
11. Neste passo, os núcleos estão prontos para prosseguir para a transposição para análise bulk e sc. Os núcleos podem ser armazenados neste ponto ressuspendidos em 90% FBS/10% DMSO a -80℃ ou em nitrogênio líquido por períodos prolongados.

Bulk ATAC-Seq

1. Pelote 5000–100.000 núcleos a 800 ×g por 5 min a 4℃.
2. Aspire o sobrenadante sem perturbar o pelote.
3. Ressuspenda o pelote celular em 50 μL de mistura de transposição pipetando para cima e para baixo 6 vezes e adicione 2,5 μL de transposase Tn5 (100 nM final).
4. Incube a reação a 37℃ por 30 min em um termomixer com agitação a 850 rpm.
5. Purifique usando um Kit Qiagen MinElute e elua o DNA transposto em 12 μL de Tampão de Eluição.

Amplificação de DNA

1. Amplifique o DNA transposto preparando uma reação de 50 μL contendo: 12 μL do DNA transposto, 2 μL de 5 μM Primer de PCR Nextera Personalizado 1, 2 μL de 5 μM Primer de PCR Nextera Personalizado 2, 0.3 μL de 100× SYBR Green I, 25 μL de NEBNext High-Fidelity 2× PCR Master Mix e 8.7 μL de água livre de nucleases.
2. Execute o seguinte programa de PCR: 1 ciclo de 5 min a 72℃ e 30 s a 98℃ seguido por N ciclos de 10 s a 98℃, 30 s a 63℃ e 1 min a 72℃.
3. O número de ciclos depende do número inicial de núcleos transpostos. O protocolo descrito anteriormente (OMNI) recomenda a realização de uma reação inicial de 5 ciclos seguida por uma reação lateral de qPCR para monitorar a reação de amplificação e estimar o número de ciclos adicionais a serem adicionados. No entanto, para facilitar o cálculo dos ciclos necessários para amplificar: adicione 15 ciclos ao começar com <10.000 núcleos; adicione 13–14 ciclos de 10.000–50.000 núcleos; adicione 12–13 ciclos para 50.000–100.000 núcleos.
4. Prossiga para o sequenciamento da biblioteca, análise inicial das sequências e controle de qualidade (QC).

Referência:

1. Cejas P, Long H W. Análise ATAC-Seq de Alta Resolução de Tecidos Clínicos Congelados[M]//Chromatin. Humana, Nova Iorque, NY, 2022: 259-267.