Visão Geral da Tecnologia de Sequenciação por Nanoporos

Resumo

Os genes codificam toda a informação hereditária de um organismo, e o sequenciamento é o processo de conversão dos sinais químicos do ADN em sinais computáveis digitalmente, tornando o sequenciamento indispensável na pesquisa genómica. O advento de Sequenciação de Sanger a sequenciação de primeira geração impulsionou a realização do Projeto Genoma Humano, marcando avanços significativos na tecnologia de sequenciação genómica nas últimas décadas. O contínuo avanço de sequenciação de nova geração as tecnologias de sequenciação de nova geração (NGS) levaram a uma redução progressiva no custo da sequenciação genómica, juntamente com aumentos na capacidade de sequenciação e na precisão, facilitando a análise da estrutura do genoma e o estudo da variação genética genómica, avançando assim significativamente a investigação genómica. No entanto, na sequenciação NGS, os erros introduzidos pela amplificação por PCR durante a construção da biblioteca e os comprimentos de leitura tipicamente curtos (frequentemente inferiores a 500pb) impedem frequentemente que a tecnologia atenda às exigências mais elevadas de algumas investigações biológicas modernas. Por exemplo, surgem desafios na determinação de segmentos repetitivos mais longos no DNA e na avaliação das modificações de metilação de DNA/RNA. Consequentemente, o surgimento de tecnologias de sequenciação de terceira geração, como a Sequenciação por Nanoporos, aborda essas limitações. A Sequenciação por Nanoporos permite a determinação de comprimentos de leitura mais longos (até 10kbp) sem a necessidade de processos complexos de construção de bibliotecas. Nos últimos anos, Sequenciação por Nanoporos tem atraído ampla atenção da comunidade científica.

Visão geral da sequenciação por nanopores

1. O que é a sequenciação por nanoporo?

A sequenciação envolve principalmente a identificação das quatro bases nucleotídicas no ADN. Devido às notáveis semelhanças químicas entre as bases purinas e pirimidinas, distingui-las apresenta desafios significativos. Atualmente, a presença das quatro bases é convertida principalmente em sinais como luz, sinais elétricos ou de pH, e as diferenças na amplificação do sinal são utilizadas para identificar as diferentes bases. Sequenciação por nanoporo, no entanto, converte as quatro bases diretamente em sinais elétricos, permitindo a sua identificação através de variações nos sinais de corrente e padrões de forma de onda. Além disso, a sequenciação por nanoporo difere das técnicas tradicionais de primeira geração e NGS, que envolvem a síntese e sequenciação simultâneas. A sequenciação por nanoporo sequencia diretamente moléculas individuais, eliminando a necessidade de amplificação por PCR durante a sequenciação, mitigando assim eficazmente erros sistemáticos resultantes de vieses da PCR. Originando-se na década de 1980, a sequenciação por nanoporo tem avançado continuamente com o desenvolvimento de proteínas de nanoporo e proteínas motoras, culminando, em última análise, na sua realização.

Marcos na sequenciação de DNA por nanopore (David et al., 2016)

2. Como funciona o sequenciamento por nanoporo?

O princípio de funcionamento da sequenciação por nanoporo

Em sequenciação por nanoporoAs proteínas de nanoporo são imobilizadas numa membrana polimérica e submersas numa solução eletrolítica, com apenas os nanoporos na membrana a permitir a passagem de iões. Ao aplicar uma diferença de potencial estável através dos nanoporos utilizando uma fonte de energia externa, os iões eletrolíticos passam pelos nanoporos, gerando uma corrente elétrica através da membrana. Orientadas por proteínas motoras, as moléculas de DNA de cadeia dupla (dsDNA) (ou duplexes híbridos de RNA-DNA) são primeiro desenroladas, permitindo que o DNA ou RNA de cadeia simples transloque através do nanoporo do lado negativo (cis) para o lado positivo (trans). Devido aos diferentes volumes e propriedades de carga dos nucleotídeos, a sua passagem através do nanoporo induz alterações distintas na corrente elétrica através da membrana, permitindo a identificação e sequenciação de sequências de DNA.

A primeira proteína de nanoporo descoberta que influencia correntes iónicas e permite a sua deteção através de DNA ou RNA foi a α-Hemolisina, uma proteína de membrana derivada de S. aureus. Outra proteína de nanoporo comumente utilizada é a MspA, com diâmetros de poro próximos de 1-2 nm. No entanto, na ausência de proteínas de nanoporo, a translocação de DNA ocorre demasiado rapidamente para obter sinais de corrente eléctrica significativos, sendo necessária a introdução de proteínas motoras para controlar a taxa de translocação de DNA. Em 2012, investigadores descobriram que a polimerase de DNA phi29, quando utilizada como proteína motora em conjunto com as proteínas de nanoporo mencionadas, regula eficazmente a translocação de DNA, produzindo sinais claros e de alta resolução.

Princípio da sequenciação por nanoporo (Wang et al., 2021)

O fluxo de trabalho da sequenciação por nanoporo

Extração de ADNExtração de DNA ou RNA de organismos ou tecidos, seguida de purificação.

Construção de bibliotecaA reparação de extremidades e a ligação de adaptadores são realizadas em DNA ou RNA. Estas sequências de adaptadores contêm sequências específicas que interagem com a proteína do nanopore no dispositivo de sequenciação por nanopore, permitindo que as moléculas sejam guiadas com precisão através do nanopore. Subsequentemente, são realizados controlos de qualidade e seleção de tamanho de fragmentos para garantir que a distribuição de tamanho e qualidade das moléculas na biblioteca cumpra os requisitos.

Carregamento e sequenciaçãoA biblioteca construída é carregada no dispositivo de sequenciação por nanoporo para sequenciação. Dentro do dispositivo, as moléculas são guiadas através do nanoporo, e as sequências de DNA ou RNA são sequenciadas ao monitorizar as alterações na corrente elétrica.

Fluxo de preparação de bibliotecas para Tecnologias Oxford Nanopore (ONT) (Wang et al., 2021)

3. Aplicações poderosas de sequenciação por nanoporo

A aplicação no sequenciamento do genoma

A utilização de tecnologia de sequenciação por nanopore O sequenciamento de genomas é extenso. Pode ser utilizado para melhorar os genomas de referência existentes, sendo o genoma de referência humano um exemplo principal. Atualmente, o sequenciamento por nanoporo preencheu 12 lacunas (>50 kb cada) no genoma de referência humano, incluindo sequências de repetições teloméricas e centrómeros do cromossomo Y. Para além do genoma humano, os genomas de referência de outras espécies também podem ser expandidos e refinados utilizando o sequenciamento por nanoporo. Ao identificar com precisão regiões repetitivas, por exemplo, o genoma de referência de Caenorhabditis elegans foi expandido em mais de 2 Mb. O sequenciamento por nanoporo também foi utilizado para ler genomas não de referência previamente não reportados, como a montagem do primeiro genoma de Rhizoctonia solani utilizando dados de sequenciamento por nanoporo. Para vírus de RNA, a ONT também pode sequenciá-los, como o vírus Zika, o vírus da gripe, entre outros. Durante a pandemia de COVID-19, a ONT ajudou a determinar rapidamente o genoma viral completo do SARS-CoV-2 através do sequenciamento de cDNA e sequenciamento direto de RNA, fazendo contribuições significativas para os esforços subsequentes de desenvolvimento de vacinas.

A aplicação na epigenética

O papel de sequenciação por nanoporo A investigação em epigenética está a tornar-se cada vez mais proeminente. Estudos independentes já em 2013 demonstraram a capacidade de distinguir citosinas metiladas (5mC e 5hmC) no DNA utilizando sinais de corrente característicos na sequenciação por nanoporo MspA. Subsequentemente, o desenvolvimento de ferramentas de bioinformática permitiu a identificação de três modificações do DNA (6mA, 5mC e 5hmC) a partir de dados da ONT. Métodos como MeSMLR-seq e SMAC-seq, que combinam a sequenciação da ONT com o tratamento com metiltransferase exógena, foram concebidos para mapear a ocupação de nucleossomas e a acessibilidade da cromatina. Adicionalmente, a sequenciação da ONT permite a caracterização simultânea de várias características epigenéticas em longas moléculas de DNA humano, incluindo o metiloma endógeno 5mC e a ocupação de nucleossomas. Abordagens experimentais como DiMeLo-seq e BIND&MODIFY também integram a sequenciação da ONT com diversas técnicas bioquímicas para mapear modificações de histonas, variantes de histonas e interações específicas proteína-DNA.

A aplicação no câncer

Sequenciação por nanopore é fundamental para a investigação do cancro, abrangendo vários tipos de cancro, como leucemia, cancro da mama, tumores cerebrais, cancro colorretal, cancro do pâncreas e cancro do pulmão. O seu papel principal reside na identificação de variações genómicas críticas, especialmente aquelas que são complexas e extensas. Por exemplo, em pacientes com leucemia linfocítica crónica, a sequenciação de amplicões por nanoporo detecta eficazmente mutações no TP53. Além disso, ao combinar o enriquecimento de alvos assistido por Cas9 com a sequenciação por nanoporo, análises detalhadas do gene de suscetibilidade ao cancro da mama BRCA1 e das suas regiões adjacentes, cobrindo uma extensão de 200 kb, fornecem informações sobre a gama completa de alterações genéticas em genes relevantes para a doença. A sequenciação por nanoporo também identifica diretamente modificações no ADN, capturando alterações genómicas e epigenómicas em amostras de tumores cerebrais, oferecendo assim uma ferramenta de diagnóstico molecular versátil e rápida para o cancro. Adicionalmente, a sequenciação de cDNA MinION permite a deteção no mesmo dia de genes de fusão em amostras clínicas. A eficiência desta tecnologia simplifica todo o processo, desde a recolha de amostras até à análise bioinformática e estratégias de tratamento personalizadas, tudo alcançado num único dia. Para além do cancro, a sequenciação por nanoporo apresenta uma promessa considerável na investigação de doenças infecciosas e hereditárias.

4. Quais são as vantagens da sequenciação por nanoporo?

Sequenciação por nanoporo apresenta várias vantagens:

• A preparação de amostras para sequenciação é extremamente fácil.
• O comprimento da leitura é excecionalmente longo, atingindo vários milhões de pares de bases, superando o sequenciamento de segunda geração em 1.000 vezes, e também ultrapassando o sequenciamento Pac Bio de terceira geração (dezenas de milhares de pares de bases).
• Pode sequenciar diretamente moléculas de RNA e detectar modificações epigenéticas, como a metilação do DNA.
• O custo é baixo, aproximadamente 150 dólares por experimento (execução).
• A velocidade de sequenciação é rápida, com a preparação da amostra a levar aproximadamente 10 minutos e a sequenciação cerca de 40 minutos.

Perguntas Frequentes

1. Qual é a diferença entre Illumina e Nanopore?

Illumina e Nanopore são duas metodologias de sequenciação amplamente reconhecidas, cada uma caracterizada por princípios e abordagens operacionais únicos.

A sequenciação Illumina, categorizada como sequenciação de segunda geração, segue o princípio da síntese e sequenciação simultâneas. Este método implica fragmentar o DNA em sequências mais curtas, seguido de sequenciação paralela com alta capacidade de processamento. Apesar da sua notável precisão e custo-efetividade, a sequenciação Illumina produz tipicamente comprimentos de leitura relativamente curtos, geralmente variando de algumas centenas a alguns milhares de pares de bases.

Em contraste, Sequenciação por nanoporo apresenta uma abordagem distinta, sequenciando diretamente moléculas de DNA ou RNA através de nanoporos, eliminando a necessidade de amplificação por PCR. Durante o sequenciamento por Nanopore, à medida que o DNA passa através de nanoporos minúsculos, as alterações na corrente elétrica induzidas pelos nucleotídeos são capturadas e processadas para gerar sequências de DNA. Esta técnica oferece a notável vantagem de comprimentos de leitura ultra-longos, que se estendem até milhões de pares de bases. Além disso, o sequenciamento por Nanopore simplifica o processo e facilita a análise rápida de dados em tempo real. No entanto, é importante notar que o sequenciamento por Nanopore pode apresentar uma precisão ligeiramente reduzida em comparação com o sequenciamento Illumina.

2. O que é sequenciação por nanoporo de Oxford?

O Sequenciamento por Nanoporos (ONS) é uma tecnologia de sequenciamento de DNA e RNA de ponta, pioneira pela ONT. No cerne desta técnica está a utilização de um poro proteico em escala nanométrica embutido numa membrana polimérica altamente resistente. Durante o processo de sequenciamento, uma tensão constante é aplicada através da membrana, permitindo que moléculas de DNA ou RNA de cadeia simples, carregadas negativamente, atravessem o nanoporo. À medida que estas moléculas de ácidos nucleicos passam pelo nanoporo, induzem flutuações na corrente iónica, que correspondem à sequência de nucleotídeos que atravessa o nanoporo e podem ser decodificadas em tempo real utilizando algoritmos de computador, permitindo o sequenciamento instantâneo de DNA ou RNA. A tecnologia de sequenciamento por nanoporos possui várias características notáveis, incluindo comprimento de leitura longo, sequenciamento em tempo real, sequenciamento direto de RNA e portabilidade. A aplicação da ONT abrange diversos campos, incluindo genómica, transcriptómica, epigenética e investigação de doenças infeciosas. À medida que a tecnologia continua a avançar, espera-se que o seu alcance e impacto se expandam ainda mais.

3. A sequenciação por nanoporo é a mais precisa?

Sequenciação por nanopore A tecnologia representa uma abordagem inovadora para o sequenciamento de ADN, oferecendo benefícios distintos que os métodos tradicionais muitas vezes não possuem. As suas características notáveis incluem comprimentos de leitura excepcionalmente longos e a capacidade de realizar análise de dados em tempo real, distinguindo-a das técnicas de sequenciamento convencionais. No entanto, embora o sequenciamento por nanoporo se destaque nessas áreas, a sua precisão pode não corresponder sempre à de métodos alternativos. Em relação à precisão, o sequenciamento por nanoporo frequentemente apresenta taxas de erro mais elevadas em comparação com plataformas estabelecidas como o sequenciamento Illumina. As plataformas Illumina normalmente produzem dados de leitura curta com taxas de erro que variam de 0,1% a 1%, enquanto o sequenciamento por nanoporo pode apresentar taxas de erro entre 6% a 15%. Consequentemente, aplicações que exigem a máxima precisão, como a deteção de polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) ou análise de variantes em pequena escala, podem considerar o sequenciamento por nanoporo subótimo.

Para mitigar problemas de precisão, os investigadores utilizam diversas estratégias, incluindo múltiplas iterações de sequenciação da mesma molécula de ADN para gerar sequências de consenso, empregando abordagens híbridas de correção de erros que integram dados de leituras longas e curtas, e avançando algoritmos de chamada de bases. Apesar desses esforços, a precisão da sequenciação por nanoporo permanece limitada pela sua natureza de sequenciação de moléculas únicas, caracterizada por uma relação sinal-ruído relativamente baixa ao nível da molécula individual.

Em resumo, a sequenciação por nanoporo apresenta vantagens incomparáveis em aplicações específicas, particularmente aquelas que necessitam de leituras longas e análises em tempo real. No entanto, a sua precisão pode não superar a de certas tecnologias de sequenciação estabelecidas. Consequentemente, a escolha da metodologia de sequenciação depende dos requisitos e objetivos precisos do empreendimento de investigação.

Referências:

1. Deamer D, Akeson M, Branton D. Três décadas de sequenciação por nanoporo. Nat Biotechnol. 2016;34(5):518-524. doi:10.1038/nbt.3423
2. Wang Y, Zhao Y, Bollas A, Wang Y, Au KF. Tecnologia de sequenciação por nanoporo, bioinformática e aplicações. Nat Biotechnol. 2021;39(11):1348-1365. doi:10.1038/s41587-021-01108-x