Um Guia Abrangente sobre Tecnologias de Tipagem Molecular de HLA: Desde Métodos Baseados em PCR até NGS

No campo de investigação cruzada da medicina moderna e da imunologia, a inovação iterativa de Tipagem do Antígeno Leucocitário Humano (HLA) A tecnologia continua a promover o desenvolvimento da medicina de precisão. Como uma ponte importante entre o polimorfismo genético e o mecanismo de regulação da resposta imunitária, a tipagem HLA desempenha um papel de suporte fundamental no emparelhamento entre dadores e recetores em transplantes de órgãos e na investigação da patogénese de doenças autoimunes.

Comparado com o método tradicional de tipagem serológica baseado no reconhecimento específico de anticorpos, a tecnologia de Tipagem Molecular de HLA conseguiu realizar uma mudança de paradigma da análise do fenótipo antigénico para a identificação precisa do genótipo através da análise aprofundada da sequência de nucleótidos dos loci de HLA. Este avanço técnico melhorou significativamente a resolução da tipagem de HLA e estabeleceu uma nova estrutura de pesquisa nos campos da descoberta de alelos raros, previsão de rejeição de transplantes e avaliação de prognóstico.

Este artigo apresenta de forma abrangente a tecnologia de tipagem molecular de HLA, desde o método baseado em PCR até ao NGS, analisando e comparando as tecnologias principais e a seleção de tecnologia com base nas necessidades.

O que é Tipagem Molecular de HLA

A tipagem molecular de HLA, ou seja, a tipagem de HLA a nível molecular, refere-se ao método de deteção direta da sequência de nucleotídeos do gene HLA através de tecnologia de biologia molecular, para determinar o tipo de alelo HLA de indivíduos. Como componente central do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), o HLA é altamente polimórfico, especialmente o HLA-A, HLA-B e HLA-DRB1, e o número de alelos já atingiu milhares. O núcleo da tipagem molecular de HLA é analisar o polimorfismo do gene HLA a partir do nível do DNA, o que fornece uma base molecular para a medicina de precisão e investigação relacionada com o sistema imunitário.

Estrutura das moléculas HLA Classe I e Classe II (Deshpande, 2017)

Diferença em relação aos Métodos Serológicos Tradicionais

A tipagem tradicional de HLA baseia-se principalmente em métodos serológicos, que classificam os antígenos HLA na superfície celular por meio de anticorpos. No entanto, os métodos serológicos têm limitações óbvias.

• Baixa resolução: Os métodos serológicos só conseguem identificar o nível de especificidade do antigénio, mas não conseguem distinguir alelos com sequências de aminoácidos altamente semelhantes, o que dificulta o atendimento às necessidades de tipagem de alta resolução clínica.
• Dependendo da qualidade do antissoro: A preparação e preservação do antissoro são rigorosas, e existem diferenças entre lotes, o que pode levar a resultados de tipagem imprecisos.
• Incapaz de detectar novos alelos: Para os novos alelos HLA que ainda não foram descobertos, os métodos serológicos não conseguem identificá-los devido à falta de anticorpos correspondentes.

Em contraste, a tipagem molecular de HLA tem vantagens óbvias:

• Baseado na deteção de ADN: A sequência do gene HLA é analisada diretamente, o que evita a influência da expressão anormal de antígenos de superfície celular nos resultados da tipagem.
• Tipagem de alta resolução: Pode ser precisa ao nível do alelo, distinguindo até alelos com apenas uma diferença de nucleótido, e fornecer uma base de correspondência mais precisa para aplicações clínicas, como o transplante de órgãos.
• Descoberta de novos alelos: Através de técnicas de biologia molecular, especialmente NGSnovos alelos HLA podem ser descobertos e identificados, e a base de dados HLA será continuamente enriquecida.
• O elevado grau de padronização: O fluxo de operação e a análise de dados da tecnologia de tipagem molecular podem realizar a padronização, reduzir a interferência de fatores humanos e melhorar a repetibilidade e comparabilidade dos resultados.

Ambiguidades alélicas de sequenciação de nova geração (NGS) vs sonda oligonucleotídica específica de sequência (SSOP) (Smith et al., 2019)

Comparação de Tecnologias de Tipagem Molecular de HLA

Na evolução da tecnologia de tipagem de HLA, a transição do método serológico para o método de biologia molecular marca um progresso significativo neste campo. A tecnologia de tipagem molecular construiu um sistema técnico diversificado com níveis distintos e funções complementares. Cada método técnico baseia-se nos princípios únicos da biologia molecular e demonstra um desempenho excecional na aplicação da genotipagem de HLA.

PCR-SSP

Com base na amplificação PCR de primers específicos para alelos, o PCR-SSP projetou primers específicos cujo extremo 3' é estritamente complementar à sequência alvo para os locais de polimorfismo do gene HLA. Quando existem alelos correspondentes no DNA molde, os primers combinam-se com precisão ao molde e iniciam a amplificação, resultando em bandas específicas que podem ser detectadas por eletroforese. O seu núcleo técnico reside na construção de uma biblioteca combinatória contendo centenas de pares de primers específicos e na realização da deteção simultânea de múltiplos alelos através de PCR multiplex.

A. Características técnicas

a) Operação simples e rápida: A digitação pode ser concluída em poucas horas, sem etapas complicadas de hibridação de sondas ou sequenciação.

b) Alta resolução: Pode alcançar o nível de digitação de média resolução e é adequado para a maioria das correspondências clínicas de rotina.

c) Os requisitos para as condições experimentais são baixos: Instrumentos de PCR comuns podem completá-lo, o que é adequado para laboratórios básicos.

A. Limitações

a) O design de primers é complexo: É necessário desenhar primers específicos para um grande número de alelos HLA, e a biblioteca de primers é enorme e o custo é elevado.

b) Alelos desconhecidos não podem ser detectados: Apenas alelos conhecidos podem ser detectados, e não há nada a fazer com alelos recém-descobertos.

c) A resolução de heterozigotos é limitada: para amostras de heterozigotos complexos, pode ocorrer inibição da competição entre primers, resultando em resultados de tipagem imprecisos.

Número de ambiguidades para tipagem HLA-A para os exões 1 a 5 (HDkit/XRkit) (Bouthemy et al., 2018)

PCR-SSO

A tecnologia PCR-SSO amplifica primeiro a região alvo do gene HLA por PCR e, em seguida, hibrida o produto amplificado com uma sonda oligonucleotídica específica de sequência (SSO) imobilizada numa membrana ou chip. De acordo com a existência e intensidade do sinal de hibridação, é determinado o tipo de alelo HLA.

A. Características técnicas

a) Alta resolução: A tipagem de alta resolução pode ser alcançada, especialmente para a tipagem do gene HLA-II.

b) Alto fluxo: Múltiplos loci e alelos podem ser detectados simultaneamente através da tecnologia de chip.

c) Os resultados podem ser quantificados: A intensidade do sinal de hibridização pode refletir a abundância da sequência alvo, o que ajuda a analisar amostras heterozigóticas.

B. Limitações

a) Os passos da operação são complicados: são necessárias a amplificação por PCR, hibridação, lavagem da membrana e deteção de sinal, o que leva muito tempo.

b) Sensível às condições experimentais: pequenas alterações na temperatura de hibridização e na concentração de sal podem afetar os resultados da hibridização.

c) É difícil manter a biblioteca de sondas: com o aumento do número de alelos HLA, a biblioteca de sondas precisa ser atualizada constantemente, e o custo é elevado.

Número de ambiguidades de alelos nulos para tipagem de HLA-A, HLA-B e HLA-DRB1 (Bouthemy et al., 2018)

Sequenciação de Sanger

Sequenciação de Sanger é uma tecnologia de sequenciação de DNA baseada no método de terminação da cadeia dideóxi, que determina o tipo de alelo lendo a sequência de nucleótidos do gene HLA. Para a tipagem HLA, a sequenciação de Sanger é geralmente utilizada após a amplificação direcionada, ou seja, o exon alvo do gene HLA é amplificado por PCR primeiro, e depois os produtos amplificados são sequenciados em duas direções.

A. Características técnicas

a) Método padrão ouro: O sequenciamento de Sanger foi uma vez o padrão ouro para tipagem de HLA, com alta precisão e fiabilidade.

b) Sequência de leitura direta: A sequência de nucleotídeos do gene HLA pode ser obtida diretamente, o que fornece a evidência mais direta para a identificação de alelos.

c) Adequado para a identificação de novos alelos: Novos alelos HLA podem ser encontrados e identificados.

B. Limitações

a) Baixo fluxo: Uma sequenciação só pode analisar um fragmento de uma amostra, o que não consegue satisfazer os requisitos da tipagem quantitativa da Qualcomm.

b) Alto custo: O custo da reação de sequenciação e dos reagentes é elevado, especialmente para a deteção de múltiplos locais e exões.

c) Análise de dados complexos: Para sub-amostras heterozigóticas, é moroso e trabalhoso fazer manualmente a junção e análise da sequência.

Tempo e esforço para sequenciação de próxima geração (NGS) e fluxos de trabalho de sondas oligonucleotídicas específicas de sequência (SSOP) (Smith et al., 2019)

NGS

tecnologia NGS, também conhecida como a tecnologia de sequenciação de nova geração, pode sequenciar simultaneamente um grande número de fragmentos de genes HLA através de sequenciação paralela em grande escala. Para tipagem de HLA, geralmente utiliza-se captura direcionada ou PCR multiplex para amplificar todos os exões ou sequências completas dos genes HLA, e depois a sequenciação de alto rendimento é utilizada para comparar as leituras de sequenciação com a base de dados de referência de HLA através de análise bioinformática, de forma a determinar o tipo de alelo.

A. Características técnicas

a) Quantidade da Qualcomm: Um sequenciamento pode completar a tipagem de múltiplos loci HLA de várias amostras, o que melhora significativamente a eficiência de deteção.

b) Alta resolução: a análise da sequência completa dos genes HLA pode ser realizada, atingindo o nível de tipagem de alta resolução e até mesmo análise de haplótipos.

c) Cobertura abrangente: pode detectar todos os exões do gene HLA, incluindo regiões altamente polimórficas, e evitar a omissão de locais polimórficos importantes.

d) Descoberta de novos alelos: Através de sequenciação imparcial, novos alelos HLA podem ser eficientemente descobertos e identificados, e a atualização da base de dados HLA pode ser promovida.

B. Limitações

a) Elevados requisitos para equipamentos e tecnologia: são necessários equipamentos profissionais de NGS e uma plataforma de análise bioinformática, além de elevados requisitos para as condições laboratoriais e para a tecnologia do pessoal.

b) Análise de dados complexos: dados de sequenciação massiva necessitam de processos bioinformáticos complexos para análise, incluindo alinhamento de sequências, alocação de alelos, etc., o que requer elevados recursos computacionais e algoritmos.

c) Custo mais elevado: Embora o custo do sequenciamento único esteja a diminuir com o desenvolvimento da tecnologia, o custo do investimento em equipamentos e da análise de dados na fase inicial continua a ser elevado.

Comparação dos métodos comuns de tipagem HLA (Shahrabi et al., 2019)

Vantagens do NGS na tipagem molecular de HLA

No campo da tipagem HLA de alta resolução, a tecnologia NGS transforma o paradigma de deteção com as suas vantagens únicas. Permite a cobertura total dos genes HLA através da sequenciação paralela da Qualcomm, consegue analisar com precisão heterozigotos complexos, melhora significativamente a taxa de deteção de alelos raros, fornece dados de haplótipos precisos para o emparelhamento em transplantes e investigação de associações com doenças, e promove a tipagem HLA para saltar de uma resolução média para a identificação precisa de alelos.

Cobertura Total do Gene

As técnicas tradicionais de tipagem de HLA, como PCR-SSP e PCR-SSO, geralmente apenas detetam algumas regiões altamente polimórficas dos genes HLA e podem não identificar locais polimórficos em outras regiões. A tecnologia NGS pode cobrir todos os exões ou sequências completas dos genes HLA através de captura direcionada ou amplificação por PCR multiplex. As vantagens desta cobertura total do gene são:

• Evitar omitir locais polimórficos importantes: O polimorfismo do gene HLA não existe apenas na região clássica de ligação ao antígeno, mas também pode estar distribuído em outras regiões. O polimorfismo dessas regiões pode afetar a expressão e estabilidade das moléculas HLA ou a interação com outras moléculas, afetando assim a resposta imunitária. A cobertura total do gene pode garantir que todos os locais polimórficos que podem afetar a função do HLA sejam detetados.
• Análise precisa de alelos complexos: Alguns alelos HLA podem ter combinações de mutações em múltiplos loci, e a deteção apenas de algumas regiões pode levar à identificação errada de alelos. A cobertura total do gene pode fornecer informações de sequência completas e garantir uma análise precisa de alelos complexos.
• A análise de haplótipos é suportada: os haplótipos HLA podem ser inferidos através do sequenciamento completo de genes e da análise bioinformática, o que é de grande importância para a compatibilidade em transplantes de órgãos e para a pesquisa de associação a doenças.

Distribuição do número de leituras por amostra e por locus (Liu et al., 2020)

Detecção de Alelos Raros

O elevado polimorfismo do gene HLA leva à existência de um grande número de alelos raros, que são menos frequentes na população geral, mas podem ser mais comuns numa população ou família específica. As técnicas de tipagem tradicionais são frequentemente difíceis de detectar alelos raros devido à limitação de primers ou bibliotecas de sondas, enquanto a tecnologia NGS apresenta vantagens óbvias na deteção de alelos raros:

• Sequenciação imparcial: A tecnologia NGS pode detetar genes HLA em amostras sem conhecer a sequência do alelo previamente, através de sequenciação em alta capacidade, de forma a encontrar e identificar alelos raros.
• Alta sensibilidade: A tecnologia NGS tem uma alta profundidade de sequenciação, consegue detetar alelos de baixa frequência e pode identificar com precisão a existência de alelos raros mesmo em amostras heterozigóticas.
• Promova a atualização da base de dados HLA: A descoberta e identificação de alelos raros ajudará a enriquecer a base de dados HLA e a fornecer um padrão de referência mais abrangente para a tipagem HLA em todo o mundo, especialmente para o estudo de doenças raras e a compatibilidade de transplantes em populações minoritárias.

Comparação inter-lotes das percentagens de leituras totais mapeadas a cada lócus (Liu et al., 2020)

Como Selecionar a Tecnologia Adequada

Com o desenvolvimento da tecnologia de tipagem HLA, é muito importante escolher o método de sequenciação apropriado para obter resultados de tipagem HLA precisos e fiáveis. Diferentes objetivos de pesquisa, requisitos de resolução, tipos de amostras, fluxo e considerações de custo afetarão a seleção dos métodos de sequenciação HLA.

Correspondência de Métodos de Tipagem HLA e Tipos de Amostras

A seleção dos métodos de sequenciação de HLA deve ser baseada no tipo de amostra. A diferença na qualidade, integridade e origem do DNA de diferentes amostras afeta diretamente a aplicabilidade e a precisão da tecnologia de sequenciação. Desde sangue fresco a amostras FFPE, desde DNA de alta qualidade a amostras micro-degradadas, é necessária uma tecnologia de correspondência precisa para garantir a fiabilidade e a eficácia da tipagem de HLA.

A. Sangue fresco

O sangue fresco é um dos tipos de amostras mais utilizados na tipagem HLA, sendo rico em glóbulos brancos e permitindo a extração de DNA de alta qualidade, adequado para muitos métodos de sequenciação. Para amostras de sangue fresco, a tecnologia NGS é a primeira escolha se forem necessários resultados de tipagem de alta resolução. A qualidade do DNA extraído do sangue fresco é elevada, o que pode satisfazer os requisitos da tecnologia NGS em termos de qualidade e quantidade de DNA. Através da NGS, é possível realizar uma tipagem de alta resolução com cobertura total do gene. Se o tamanho da amostra for pequeno ou se o tempo for urgente, a sequenciação Sanger também pode ser utilizada para a tipagem HLA de amostras de sangue fresco, especialmente para a análise de alta resolução de uma única amostra.

B. DNA de baixa qualidade

Para amostras de DNA de baixa qualidade, como DNA extraído de sangue traço, manchas de sangue seco ou outras fontes, a sua concentração e integridade podem ser deficientes. Neste caso, a tecnologia PCR-SSP pode ser mais adequada, pois requer uma quantidade relativamente pequena de DNA e, ao otimizar o design dos primers e as condições de PCR, a eficiência de amplificação de DNA de baixa qualidade pode ser melhorada. Se a tecnologia NGS tiver de ser utilizada, é necessário pré-tratar o DNA de baixa qualidade, como a amplificação do genoma completo, mas isso pode introduzir viés e deve ser considerado na análise dos dados.

Precisão das três ferramentas para tipagem de HLA na segunda ou terceira resolução de campo para diferentes profundidades e comprimentos de leitura (Liu et al., 2021)

Pesquisa de Correlação de Doenças

No estudo da artrite reumatóide (AR), a PCR-SSP tradicional só consegue detectar a especificidade do antígeno HLA-DR4, enquanto a NGS pode distinguir os subtipos HLA-DRB1*04:01/04:04. Os investigadores utilizaram NGS para sequenciar todo o cluster do gene HLA e descobriram que o HLA-DQB103:02 estava independentemente relacionado com a gravidade da doença (OR=1,32, IC 95% 1,17-1,49), exceto o clássico Epítopo Partilhado. A ligação do haplótipo HLA-DRB1-DQA1-DQB1 foi analisada com sucesso utilizando a tecnologia de sequenciação de leitura longa 10X Genomics, o que não poderia ser alcançado pela tecnologia de leitura curta.

Acordo de previsão positiva dos sete algoritmos para tipagem HLA em diferentes resoluções e genes (Liu et al., 2021)

Conclusão

O desenvolvimento da tecnologia de tipagem molecular de HLA passou pela transição de métodos serológicos tradicionais para técnicas de biologia molecular. Atualmente, as tecnologias de tipagem molecular mais utilizadas incluem PCR-SSP, PCR-SSO, sequenciação Sanger e NGS. Cada tecnologia tem as suas vantagens e limitações únicas. Na aplicação prática, a tecnologia adequada deve ser selecionada de acordo com requisitos específicos (como requisitos de resolução, tamanho da amostra, tempo e custo, etc.).

Com o contínuo desenvolvimento da tecnologia e a redução de custos, a tecnologia NGS será mais amplamente utilizada na tipagem de HLA. Ao mesmo tempo, combinada com o desenvolvimento da bioinformática e da inteligência artificial, a precisão e a eficiência da tipagem de HLA serão ainda mais melhoradas, proporcionando um suporte técnico mais sólido para a investigação e aplicação clínica da medicina de precisão e das doenças relacionadas com o sistema imunitário.

Referências:

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3. Bouthemy C, Ralazamahaleo M, et al. "Melhoria na tipagem de HLA por novos kits de oligonucleotídeos específicos de sequência para os loci HLA-A, -B e -DRB1." HLA2018 92(5): 279-287 Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Posso ajudar com traduções de texto que você fornecer.
4. Shahrabi S, Hadad EH., et al. "Antígenos leucocitários humanos na metastização do câncer: Abordagem prognóstica e suscetibilidade terapêutica." Histol Histopatol2019 34(2): 111-124 Desculpe, mas não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça-o e terei prazer em ajudar com a tradução.
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