O que é uma mutação genética?
As mutações genéticas, alterações no código genético, podem ter impactos significativos no crescimento e desenvolvimento dos organismos. Muitas vezes, essas mutações resultam na perda da função original do gene, perturbando a relação coordenada entre os genes e os processos metabólicos relacionados. As consequências podem manifestar-se como variações de traços, desenvolvimento anormal dos indivíduos, redução da competitividade para a sobrevivência e reprodução ou, em casos extremos, levar a mutações letais.
| Tipo de Mutação |
Descrição |
Tipo de Mutação |
Descrição |
Leitura Recomendada |
| Mutação Pontual |
A mutação pontual envolve uma alteração numa única base ou par de bases do ADN, levando a variações no código genético. |
Mutação Sinónima |
Isto ocorre quando uma substituição de base acontece na sequência codificadora de um gene. No entanto, devido à redundância do códon, o códon mutado e o códon original podem codificar para o mesmo aminoácido, resultando em nenhuma alteração na proteína traduzida. |
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| Mutação Missense |
Neste cenário, uma substituição de base na sequência codificadora do gene altera o códon, levando à codificação de um aminoácido diferente. Esta alteração faz com que a cadeia polipeptídica perca a sua função original, resultando em anomalias na proteína. |
| Mutação Sem sentido |
Uma mutação na sequência codificadora do gene forma um dos três códon de parada (UAG, UAA, UGA). Esta mutação resulta na terminação prematura da síntese proteica, levando a uma proteína encurtada. Esta truncagem pode potencialmente impactar ou interromper completamente a função da proteína. |
| Mutação de Inserção-Deleção (Indel) |
Indel envolve a inserção ou deleção de um determinado comprimento de nucleotídeos numa posição específica no genoma. |
Mudança de quadro (fs) |
Isto ocorre quando uma ou mais bases, que não são múltiplos inteiros de 3, são inseridas ou deletadas na cadeia de DNA. Isto perturba o quadro de leitura na região codificadora, alterando a sequência de bases e levando a mudanças nos aminoácidos traduzidos. |
| Mutação Não-Deslocada |
Se uma ou mais bases forem inseridas ou deletadas em um múltiplo inteiro de 3 numa cadeia de DNA, a sequência de bases na região codificadora é alterada. Isso resulta numa mudança no aminoácido traduzido sem perturbar o quadro de leitura. |
| Mutação Dinâmica |
A mutação dinâmica, também conhecida como mutação de sequência de repetição de trinucleotídeos instável, é causada pela amplificação de repetições de trinucleotídeos na sequência codificadora do gene ou na sequência adjacente. O número de amplificações repetitivas pode aumentar ao longo das gerações, demonstrando um efeito cumulativo de mutação, daí o termo mutação dinâmica. É comum em vários distúrbios genéticos, como a doença de Huntington, a síndrome do X frágil, a ataxia espinocerebelar e a distrofia muscular anquilosante. |
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Tecnologias de ponta, como o sequenciamento de alto rendimento e o sequenciamento de leituras longas, utilizadas pela CD Genomics, facilitam a análise robusta de mutações genéticas. Esta abordagem avançada de sequenciamento permite uma análise abrangente e eficiente do material genético, proporcionando informações valiosas sobre o panorama molecular e potenciais biomarcadores associados a várias condições.
Classificação de Mutações
As mutações são classificadas com base nas suas origens em dois tipos principais: mutações espontâneas e mutações induzidas, cada uma surgindo de causas distintas. As mutações espontâneas abrangem aquelas que ocorrem naturalmente, impulsionadas por fatores como mutagénicos naturais ou erros durante a replicação e reparação do DNA. Por outro lado, as mutações induzidas resultam da utilização intencional de mutagénicos artificiais. Os mutagénicos apresentam várias formas, incluindo mutagénicos físicos como radiação ionizante e luz ultravioleta, mutagénicos químicos como nitrito e brometo de etídio, e mutagénicos biológicos como retrovírus.
A categorização adicional das mutações baseia-se nas células responsáveis pela sua produção. As mutações em células somáticas e as mutações em células germinativas são dois tipos principais. As mutações em células somáticas, que surgem em células não reprodutivas, não são transferidas diretamente para a próxima geração. Em contraste, as mutações em células germinativas, que ocorrem em células reprodutivas, têm uma maior probabilidade de serem herdadas pela prole.
Outra perspetiva para a categorização considera as regiões que produzem mutações. A nível celular, as mutações cromossómicas envolvem alterações no número e na estrutura dos cromossomas dentro de uma célula. Entretanto, a nível molecular, as mutações genéticas envolvem mudanças na composição e na sequência de bases dentro dos genes.
Características da Mutação
A perceção das mutações como prejudiciais ou benéficas é relativa e, em certas instâncias, os seus efeitos podem transformar-se. Por exemplo, uma mutação de resistência pode ser considerada favorável, como se vê em culturas com mutantes anões que prosperam em ambientes ventosos e com alto teor de fertilizante.
- A Prevalência e a Raridade das Mutações Genéticas
As mutações genéticas são ubíquas no mundo biológico, ocorrendo tanto em organismos inferiores como superiores, através de meios naturais e artificiais. No entanto, no seu estado natural, as mutações são excecionalmente raras, com genes do tipo selvagem a exibirem uma taxa de mutação muito baixa.
- Aleatoriedade e Natureza Não Direcionada das Mutações Genéticas
a. Aleatoriedade no Local: As mutações genéticas podem ocorrer em células somáticas e células germinativas, sendo que as primeiras geralmente não são transmitidas à descendência e as últimas podem ser herdadas. As mutações podem ocorrer em diferentes partes da mesma molécula de DNA ou em moléculas de DNA distintas dentro de uma célula.
b. Aleatoriedade no Tempo: As mutações genéticas podem ocorrer em qualquer fase do desenvolvimento biológico de um indivíduo e podem ser mais propensas a acontecer em indivíduos mais velhos, como os idosos que são suscetíveis ao câncer de pele.
c. Não Direcionalidade: As mutações genéticas podem ocorrer em múltiplas direções, resultando em várias formas alélicas dentro de um gene.
- Repetibilidade e Reversibilidade de Mutacões Genéticas
a. Repetibilidade: Genes mutados podem sofrer mutações adicionais de forma independente sob condições específicas, formando novas formas alélicas a uma certa frequência.
b. Reversibilidade: A direção da mutação genética é reversível.
- Paralelismo da Mutação Genética
Espécies intimamente relacionadas frequentemente sofrem mutações genéticas semelhantes devido às suas bases genéticas relativamente próximas.
Fatores de Influência
- Fatores Físicos: Exposição a raios gama, raios ultravioletas, etc.
- Fatores Químicos: Presença de análogos de bases, aflatoxina, etc.
- Fatores Biológicos: Impacto de certos vírus e bactérias, etc.
- Alteração do número, ordem e tipo de desoxirribonucleotídeos dentro de um gene, levando a mudanças na informação genética.
Tecnologia de Detecção de Mutação
ARMS-PCR
O Sistema de PCR de Mutação Refratária por Amplificação (ARMS-PCR), também conhecido como PCR Específica de Alelos (AS-PCR), utiliza uma abordagem sofisticada para controlar a extensão específica de alelos através do design estratégico de primers na extremidade 3'. Ao integrar este design de primers com a Taqman método de sonda, a tecnologia identifica com precisão tanto os alelos selvagens quanto as mutações.
No processo de PCR ARMS, nucleotídeos distintos são incorporados na extremidade 3' dos dois primers a montante correspondentes a cada alelo, com um primer específico para o tipo selvagem e o outro para o mutante. Durante a amplificação, o primer a montante que não tem uma correspondência perfeita com o molde falha em formar pares de bases complementares, levando a incompatibilidades, extensão bloqueada e à ausência de geração de produto de PCR. Em contraste, o sistema de primers que corresponde precisamente ao molde amplifica com sucesso os produtos de PCR correspondentes. Os grupos fluorescentes anexados ao Sonda TaqMan gerar sinais detectáveis, permitindo a confirmação do genótipo através da análise de dados de fluorescência. Esta abordagem meticulosa garante a identificação precisa de alelos selvagens e genes mutantes nas amostras examinadas.
PCR de Enriquecimento de Mutantes
A PCR de Enriquecimento de Mutantes é um processo de amplificação em duas etapas projetado para o enriquecimento direcionado de genes EGFR mutados. Na etapa inicial, o gene EGFR selvagem é submetido a uma digestão seletiva utilizando uma endonuclease de restrição. Este processo enriquece o gene EGFR mutado, preparando o caminho para a segunda amplificação por PCR. Subsequentemente, os produtos da PCR são detetados através de eletroforese, e a determinação do estado de mutação do gene EGFR é feita com base em características específicas dos produtos da PCR, como tamanho ou presença/ausência.
Comparado ao método de sequenciação direta, a PCR de Enriquecimento de Mutantes apresenta uma sensibilidade e especificidade aumentadas na deteção de mutações de ativação do EGFR. Notavelmente, consegue discernir um gene mutado mesmo na presença de 10^3-10^4 cópias do tipo selvagem. No entanto, é essencial reconhecer certas desvantagens inerentes a este método. A necessidade de duas amplificações por PCR e digestão enzimática torna o procedimento complexo, demorado e suscetível à contaminação. Apesar desses desafios, a sua sensibilidade e especificidade aprimoradas fazem da PCR de Enriquecimento de Mutantes uma ferramenta valiosa para a deteção precisa de mutações no gene EGFR.
Sequenciação de Sanger
Sequenciação de Sanger destaca-se como um dos métodos mais amplamente utilizados para a deteção de mutações. O seu princípio fundamental baseia-se na utilização de DNA polimerase, primers, dNTP e na omissão estratégica de um ddNTP aleatório durante o processo de amplificação por PCR. Este ddNTP, atuando como um substituto do dNTP, participa na reação de síntese da cadeia de DNA, sendo aleatoriamente incorporado na cadeia de DNA em posições específicas, dificultando assim a extensão contínua da cadeia de DNA.
Através desta abordagem, é gerada uma série de fragmentos de DNA com comprimentos variados. Estes fragmentos são posteriormente marcados fluorescentemente e submetidos a separação eletroforética, resultando em bandas fluorescentes distintas. O resultado final é a identificação do fragmento de DNA que contém o local da mutação. Sequenciação de SangerA precisão reside na sua capacidade de produzir um perfil abrangente de fragmentos de DNA, permitindo a localização precisa de mutações dentro das cadeias de DNA sequenciadas.
Sequenciação por Pirofosfato
A sequenciação por pirofosfato representa um avanço de ponta na tecnologia de análise de sequências de DNA. O princípio subjacente envolve uma abordagem de sequenciação distinta onde, em cada ciclo de reação de sequenciação, apenas um único tipo de dNTP é introduzido. Se este dNTP específico emparelhar com sucesso com o molde, a polimerase incorpora-o na nova cadeia de DNA sintetizada, libertando o grupo pirofosfato (PPi). Através de uma cascata de reações de quimioluminescência enzimática, o PPi é convertido em um sinal visível, cuja intensidade é diretamente proporcional ao número de nucleotídeos incorporados na reação.
Esta tecnologia permite a determinação rápida e precisa de fragmentos-alvo curtos sem a necessidade de eletroforese ou rotulagem fluorescente de fragmentos de DNA. Apesar da sua eficiência, vale a pena notar que o sequenciamento por pirofosfato ainda não atingiu o mesmo nível de popularidade que o sequenciamento direto. Isso se deve principalmente à sua limitada extensão de leitura e à suscetibilidade à contaminação. No entanto, a sua metodologia única posiciona-o como uma alternativa promissora para certas aplicações na análise de sequências de DNA.
Sequenciação de Nova Geração (NGS)
Avanços em Sequenciação de Nova Geração (NGS) tem impulsionado-o como uma força transformadora, oferecendo três vantagens principais em relação ao sequenciamento Sanger tradicional. Estas vantagens incluem alta capacidade de processamento, a substituição de fragmentos de ADN clonados de bactérias por bibliotecas de ADN versáteis, e a eliminação da eletroforese do processo de sequenciamento. Esta mudança de paradigma reduz significativamente o tempo e os custos de mão-de-obra associados ao sequenciamento.
Leitura recomendada: Sequenciação de Nova Geração (NGS) da Illumina: Princípios e Fluxo de Trabalho.
Nos últimos vinte anos, NGS tem ganho uma popularidade generalizada, particularmente pelo seu papel fundamental na identificação de numerosas mutações e variantes cromossómicas associadas a doenças. No âmbito das mutações genéticas relacionadas com doenças, o NGS trouxe a investigação do câncer e o diagnóstico clínico para a era genómica, concretizando a visão da medicina personalizada baseada nas características de mutação do tumor.
As aplicações de NGS em clínicas de cancro abrangem um espectro de técnicas, incluindo sequenciação do genoma completo (WGS)sequenciação do exoma completo (WES) sequenciação de painel genético direcionado (TS)sequenciação do transcriptoma, sequenciação epigenética e sequenciação de fase única. Distinções entre WGS, WES e TS surgem principalmente dos seus níveis de cobertura. O WGS cobre de forma abrangente todo o genoma a uma taxa de aproximadamente 95%-98%, enquanto o WES e o TS capturam e sequenciam seletivamente fragmentos de DNA de exomas inteiros ou genes-alvo específicos, respetivamente. Dado que apenas cerca de 2% do genoma humano é composto por sequências codificantes, WES e o TS aumentam estrategicamente a profundidade de sequenciação de forma rentável, preservando a precisão e a eficiência.
A maioria das aplicações de NGS relacionadas com o cancro adotadas comercialmente utiliza o método TS para adquirir sequências de genes relacionados com o cancro ou obter informações epigenéticas. A evolução contínua e a adoção generalizada de teorias e tecnologias de deteção de NGS relacionadas com o cancro alargaram as suas aplicações práticas em várias fases clínicas. Estas aplicações incluem agora rastreios precoces de cancro, deteção de doença residual mínima (DRM) pós-operatória e diagnósticos simultâneos para pacientes a lidar com cancros avançados.
Por favor, leia o nosso artigo. Sequenciação de Nova Geração para Descoberta de Biomarcadores de Câncer.
Tecnologia de Sequenciação de Longas Leituras de Molécula Única
O inovador tecnologia de sequenciação de leitura longa de moléculas únicas possui vantagens significativas na deteção de mutações genéticas, destacando-se na análise de "sequências difíceis" que representam desafios para técnicas convencionais. Estas podem incluir repetições em tandem curtas (STRs) ricas em GC e STRs compostas por motivos de sequência repetitivos que se desviam do genoma de referência.
Uma das principais forças do sequenciamento de leitura longa de molécula única reside na sua capacidade de contornar a amplificação por PCR, permitindo uma cobertura abrangente de toda a região do genoma, especialmente em áreas amplificadas repetidamente. Esta abordagem garante uma exploração minuciosa de toda a região de amplificação de repetições sem as limitações associadas à PCR. Além disso, a tecnologia fornece resultados mais abrangentes, englobando a totalidade das sequências repetidas, detalhes sobre os comprimentos das repetições amplificadas, números de unidades repetidas e a sua distribuição.
A alta resolução desta tecnologia é particularmente notável, pois fornece informações precisas sobre sequências interrompidas perto de repetições causadoras de doenças. Essas interrupções podem servir como marcadores valiosos para o tratamento e prognóstico de doenças. Como resultado, tecnologia de sequenciação de longas leituras de moléculas únicas é antecipado que desempenhe um papel fundamental nos diagnósticos moleculares relacionados a anomalias de amplificação de STR. A sua aplicação promete uma sensibilidade e especificidade aprimoradas para doenças dinâmicas, oferecendo aos pacientes e aos seus descendentes informações diagnósticas e terapêuticas mais detalhadas.
Diretrizes para Submissão de Amostras
