Como Preparar Amostras para Sequenciação de RNA de Exossomas: Um Guia Passo a Passo

Introdução: Um Projeto de RNA Exossomal Bem-Sucedido Começa com a Preparação de Amostras Adequada

Em sequenciação de RNA exossomal, o ponto de falha mais comum não é a construção da biblioteca ou a análise de dados—é a amostra.

Apesar dos avanços nas tecnologias de RNA-Seq, a má preparação de amostras continua a ser uma das principais razões para resultados falhados ou subótimosNa verdade, auditorias internas de QC e literatura publicada sugerem que mais de 50% das falhas da amostra rastrear erros no manuseio em fase inicial, incluindo coleta inadequada, degradação durante o transporte ou contaminação por RNA livre de células (cfRNA).

Por que é que o RNA exossomal (exoRNA) é tão vulnerável?

Baixa abundânciaexoRNA está presente em quantidades de nanogramas ou até mesmo picogramas.

Tamanho de fragmento pequenoA maioria dos exoRNAs é curta—particularmente os miARNs, que são facilmente perdidos durante a extração.

Susceptibilidade à degradaçãoAtrasos no processamento ou congelação inadequada podem danificar irreversivelmente a qualidade do RNA.

Sensibilidade à contaminaçãoAo contrário do RNA intracelular, a preparação de exoRNA deve lidar com RNA livre, proteínas e lípidos nos biofluidos.

É por isso que uma preparação adequada da amostra não é um detalhe menor—é o fundação de todo o seu projetoQuer esteja a planear um estudo de descoberta de biomarcadores, uma investigação mecanicista ou simplesmente a validar transcritos associados a vesículas, preparar as suas amostras corretamente garante que obterá dados fiáveis na primeira vez.

Este artigo fornece um guia padronizado, passo a passo para te ajudar:

• Escolha o tipo de amostra adequado para o seu estudo.
• Evite armadilhas comuns na recolha e preservação.
• Decida se vai isolar exossomas você mesmo ou submeter fluidos biológicos brutos.
• Prepare as suas amostras para submissão à nossa instalação de sequenciação.

Ao seguir estas diretrizes, reduzirá atrasos, melhorará a qualidade dos dados e manter-se-á no caminho certo em direção aos seus objetivos de pesquisa.

Se é novo nos fluxos de trabalho de exossomas, comece aqui: Protocolo de Isolamento de Exossomas para Extração de miRNA

Passo 1: Escolha o Tipo de Amostra Correto

Nem todos os biofluidos são igualmente adequados para a análise de RNA exossomal. O sucesso do seu projeto de RNA-Seq muitas vezes começa por escolher o tipo de amostra que corresponde aos seus objetivos de investigação, requisitos de entrada e expectativas de rendimento de RNA exossomal.

Abaixo está uma comparação dos tipos de amostras comuns utilizadas em estudos de RNA exossomal:

Plasma (EDTA)

Por que é preferidoO plasma coletado com EDTA é o padrão ouro na pesquisa de RNA exossomal devido ao seu elevado rendimento de vesículas e compatibilidade com a perfuração de miRNA e mRNA. Também é relativamente estável e bem documentado em vários estudos.

Melhor paraPesquisa sobre o câncer, monitorização imunológica, modelos de doenças infecciosas e desenvolvimento geral de biópsia líquida.

Evite tubos de heparina.—heparina residual inibe os fluxos de trabalho de PCR e NGS a montante.

Urina

Por que é útilA urina é fácil de coletar de forma não invasiva e é rica em vesículas do rim e do trato urinário. No entanto, o conteúdo de exoRNA tende a ser inferior ao do plasma, e a urina é mais suscetível à degradação.

Melhor paraEstudos focados na função renal, síndromes metabólicas ou exploração de biomarcadores não invasivos.

Saliva

Prós e contrasEmbora seja fácil de coletar e amigável para os pacientes, a saliva degrada-se rapidamente e contém abundantes RNases. Também apresenta uma produção variável de exossomas entre indivíduos e ao longo do tempo.

Melhor paraEstudos de viabilidade ou aplicações de nicho onde outros fluidos não estão disponíveis.

Súper-natante de Cultura Celular

Por que é idealOs exossomas provenientes de meios de cultura são altamente puros, com um fundo mínimo de cfRNA ou proteínas plasmáticas. Os investigadores podem controlar o tempo, as condições de stress e as exposições a fármacos.

Melhor paraEstudos mecanicistas, testes de fármacos, análise de vias e experimentos de curso temporal in vitro.

Escolher a amostra certa define o tom para todo o seu projeto. Na próxima seção, iremos explorar melhores práticas para a recolha e preservação de amostras—um passo crítico na manutenção da integridade do exoRNA.

Passo 2: Melhores Práticas para Coleta e Armazenamento de Amostras

O RNA exossomal é altamente sensível à degradação, contaminação e stress ambiental. Garantir um manuseio adequado desde o momento da recolha da amostra é crucial para manter a integridade do RNA e assegurar resultados de sequenciação de alta qualidade.

Esta secção descreve os principais "faça" e "não faça" para amostragem, armazenamento e transporte—baseados nas melhores práticas estabelecidas na investigação de exossomas e validadas em centenas de projetos bem-sucedidos.

Diretrizes Gerais

Utilize sempre consumíveis estéreis e livres de RNase. para tubos, pontas de pipeta e filtros. A contaminação por RNase é uma das principais causas da degradação do exoRNA.

Rotule as amostras de forma clara. com marcadores à prova de água ou autocolantes impressos que resistam ao congelamento. Evite fita adesiva que se descole a −80°C.

Para Amostras de Plasma

Tubo recomendadoEDTA (tampa lilás).

Evite a heparina—ela interfere com a PCR e a preparação da biblioteca.

Tempo de processamentoCentrífuga interna 2 horas de recolha para separar o plasma das células sanguíneas. Atrasos podem levar a um aumento da libertação de cfRNA de células lisadas.

Aliquota imediatamente em crioviais (200–500 µL por tubo). Não recongele o plasma descongelado.

Para Urina, Saliva e Supernatante de Cultura

UrinaCentrifugar para remover células e detritos dentro de 1 hora. Adicionar conservantes se for esperado um atraso.

SalivaUtilize kits de recolha que incluam inibidores de RNase e congele imediatamente.

Meios de cultura celularColete o sobrenadante em pontos de tempo pré-definidos, centrifugue a 2.000–3.000 g para remover detritos celulares e filtre se necessário.

Recomendações de Armazenamento

TemperaturaArmazene todas as amostras em −80°CUtilize criovials classificados para temperaturas ultra-baixas.

AliquotaçãoDivida em volumes de uso único para evitar ciclos de congelamento e descongelamento.

Tempo máximo de esperaPara melhores resultados, envie amostras dentro de 4 a 6 semanas de coleção se armazenados corretamente. Amostras mais antigas podem exigir uma pré-avaliação de QC.

Transporte e Envio

Método preferido: Enviar em gelo seco, utilizando recipientes isolados em espuma.

Embalagem:

Camada 1: Cryovials dentro de um saco plástico selado

Camada 2: Saco colocado numa caixa selada secundária (por exemplo, tubos cónicos de 50 mL)

Camada 3: Todos os materiais embalados em gelo seco dentro de um recipiente isolado em espuma.

Incluir um manifesto detalhado com nomes de amostras, volumes e datas de recolha.

Seguir estas melhores práticas ajuda a garantir que as suas amostras cheguem intactas e que o RNA que extraímos seja adequado para análises posteriores—seja você a direcionar pequenos RNAs como miARNs ou transcritos de comprimento completo.

Em seguida, vamos explicar o seu duas opções para enviar amostras: biofluido bruto ou exossomas pré-isolados.

Passo 3 – Prepare o Seu Próprio RNA Exossomal: O Que Deve Saber Antes da Submissão

A CD Genomics especializa-se em serviços de sequenciação de RNA exossomal e requer que os clientes submetam RNA exossomal já extraído e purificadoNão fornecemos serviços de isolamento de exossomas ou extração de RNA. Para garantir o sucesso do seu projeto, por favor, cumpra os seguintes requisitos de submissão.

O que Precisa de Submeter

Tipo de AmostraRNA exossomal purificado, livre de proteínas, DNA e inibidores enzimáticos.

QuantidadeMínimo de 20 ng por amostra.

ConcentraçãoPelo menos 1 ng/µL.

Pureza:

Relação OD260/280 entre 1,8 e 2,2.

Relação OD260/230 ≥ 2.0.

IntegridadeNúmero de Integridade do RNA (RIN) ≥ 6,5.

Buffer de Eluiçãoágua livre de RNase ou 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), sem EDTA ou outros inibidores.

ArmazenamentoArmazenar a -80°C; evitar ciclos repetidos de congelação-descongelação.

Referência: Diretrizes de Submissão de Amostras da CD Genomics

O que Evitar

Para prevenir problemas que possam comprometer os seus resultados de sequenciação:

Não Submeter:

Fluidos biológicos inteiros (por exemplo, plasma, urina, saliva ou sobrenadante de cultura celular).

Exossomas não processados ou pellets de vesículas.

Evitar:

Buffers de eluição contendo altas concentrações de sal, SDS, guanidina ou resíduos de fenol.

Buffers com EDTA, uma vez que pode inibir reações enzimáticas subsequentes.

Ciclos repetidos de congelamento e descongelamento de amostras de RNA. Se tiver dúvidas sobre a composição do seu tampão ou método de extração, entre em contacto connosco para uma verificação de compatibilidade gratuita antes da submissão.

Práticas Recomendadas de Isolamento e Extração

Embora a CD Genomics não endosse marcas específicas, recomendamos que o seu fluxo de trabalho inclua:

Isolamento de ExossomasUtilize ultracentrifugação, precipitação com polietileno glicol (PEG) ou métodos baseados em afinidade.

Extração de RNAUtilize protocolos otimizados para pequenos RNAs, garantindo um mínimo de resíduo de solventes orgânicos.

Controlo de QualidadeAvalie a integridade do RNA utilizando um Bioanalyzer ou TapeStation para confirmar os valores de RIN.

Documentação Necessária

Ao submeter as suas amostras, por favor forneça:

Um breve resumo dos seus protocolos de isolamento de exossomas e extração de RNA.

Detalhes da composição do tampão utilizado na amostra final de RNA.

Medições de concentração e os métodos utilizados.

Esta informação ajuda-nos a avaliar a compatibilidade dos inputs e a otimizar a sua estratégia de preparação de biblioteca.

Perguntas Frequentes (FAQ)

Qual é a quantidade mínima de RNA necessária para sequenciação?

Recomendamos um mínimo de 20 ng de RNA total por amostra, a uma concentração de ≥1 ng/µLPara workflows de RNA pequeno ou de baixo input, por favor contacte-nos para uma revisão de viabilidade.

Posso enviar biofluído bruto ou exossomas isolados?

Não. A CD Genomics apenas aceita RNA exossomal purificado. Por favor, extraia o RNA antes da submissão. Para diretrizes de extração recomendadas, consulte o nosso Guia de Submissão de Amostras.

Que tampão devo usar para ressuspender o meu RNA?

Utilize água livre de RNase ou 10 mM Tris-HCl (pH 8,0). Não utilize tampões com EDTA, fenol, guanidina ou sal em alta concentração, pois podem inibir enzimas posteriores.

Oferecem serviços de integridade e quantificação de RNA?

Sim. Todo o RNA submetido passa por QC através do Bioanalyzer ou TapeStation (RIN ≥6,5 recomendado), além de verificações de concentração e pureza via NanoDrop e Qubit. Você receberá um relatório completo de QC.

Consegue trabalhar com RNA degradado ou de baixo input?

Avaliamos amostras degradadas ou de baixo input caso a caso. Se a sua amostra estiver abaixo dos limiares padrão, por favor, entre em contacto connosco antecipadamente para uma consulta técnica gratuita.

Usei um kit comercial de extração de RNA—vai funcionar?

Na maioria dos casos, sim. No entanto, por favor, partilhe o seu método de extração e os detalhes do tampão para nos ajudar a avaliar a compatibilidade. Alguns kits comerciais deixam resíduos inibitórios que devem ser evitados.

Como devo embalar e enviar amostras de RNA?

Armazene o RNA a –80°C e envie em gelo seco, utilizando tubos à prova de fugas num recipiente isolado de três camadas. Evite ciclos repetidos de congelação-descongelação.

Conclusão: Amostras de Alta Qualidade Produzem Dados de Alta Qualidade

Na sequenciação de RNA exossomal, a qualidade dos seus dados é tão boa quanto a preparação da sua amostraDesde a escolha do biofluido adequado até à garantia de um armazenamento correto e compatibilidade com o tampão, cada detalhe conta. Um manuseio inadequado pode resultar em baixo rendimento, elevada degradação ou resultados inutilizáveis—desperdiçando tempo e orçamento valiosos.

Leituras Recomendadas a Seguir

O que é a Sequenciação de RNA de Exossomas?

Métodos de Isolamento de RNA de Exossomas Comparados

Como Interpretar Dados de Sequenciação de RNA Exossomal