Protocolo de Isolamento de Exossomas para Extração de miRNA

Isolamento de Exossomas a partir de Meios Condicionados

1. Coletar meio condicionado.
2. Centrifugar a 500 g (RCF) durante 10 min a 4 °C, com aceleração máxima (constante durante todo o protocolo) e desaceleração máxima (até ao Passo 9). Permite descartar células vivas.
3. Remova o sobrenadante para novos tubos. Sem perturbar ou tocar no pellet, colete todo o meio acima da linha mencionada e, em seguida, transfira-o para um novo tubo.
4. Repita os Passos 2 e 3.
5. Centrifugar a 2000 g durante 15 min a 4 °C e transferir o sobrenadante para novos tubos. Permite descartar células mortas.
6. Repita o Passo 5.
7. Centrifugar a 10.000 g durante 30 min a 4 °C e transferir o sobrenadante para novos tubos. Isso permite descartar detritos celulares e vesículas de grande diâmetro.
8. Repita o Passo 7.
9. Centrifugue o sobrenadante a 100.000 g durante 1 h a 4 °C, reduzindo a potência de travagem. Se estiver a utilizar máquinas da nova série (como Optima XPN ou XE), defina a desaceleração em "5"; no caso de máquinas da série anterior (como Optima L), defina em "travagem lenta".
10. Remova cuidadosamente a maior parte do sobrenadante (considerando sempre a linha clara antes da parte arredondada do tubo) utilizando uma pipeta de grande volume, enquanto usa uma pipeta de 1 mL ao atingir o pellet. Deixe 2/3 mL de sobrenadante para uma melhor armazenagem das suas vesículas.
11. Adicione PBS para lavar a sua preparação de exossomas e descartar contaminantes.
12. Centrifugar a 100.000 g durante 1 h a 4 °C, reduzindo a potência de travagem. Se estiver a usar máquinas da nova série, ajuste para "10"; no caso de máquinas da série anterior, ajuste para "sem travão".
13. Remova o sobrenadante como no Passo 10.
14. Ressuspenda o pellet em cerca de 200 μL de PBS.

Microscopia Eletrónica

1. Começando com 200 μL de preparação de exossomas, 25 μL são ressuspendidos em 275 μL de PBS citrato a 0,32% para atingir um volume final de 300 μL.
2. Dilua 150 μL de exossomas em 150 μL de paraformaldeído a 4%, alcançando assim uma concentração final de 2%. Este passo permite fixar as suas vesículas.
3. Incubar durante a noite a 4 °C.
4. Aplique 10 μL de vesículas fixas em grelhas de EM revestidas de carbono/formvar durante 7 minutos.
5. Mancha com acetato de uranilo a 2% durante 30 min à temperatura ambiente.
6. Deixe as vesículas desidratar durante 2 horas à temperatura ambiente.
7. Imagem com TEM a 100 kV.

Análise do Conteúdo de Exo-miRNAs

1. Resuspenda a preparação de exossomas em 1 mL de reagente TRIzol. Agite vigorosamente, vortexe e armazene a −80 °C durante a noite.
2. Descongele as amostras à temperatura ambiente, adicione 200 μL de 2-bromo-3-cloropropano (ou clorofórmio) e agite o tubo vigorosamente. Incube durante 5 minutos à temperatura ambiente.
3. Centrifugar a 12.000 g durante 15 min a 4 °C.
4. Transfira a fase aquosa para um novo tubo.
5. Adicione 500 μL de álcool isopropílico frio e agite vigorosamente.
6. Congelar a −80 °C durante 1 h.
7. Centrifugar a 12.000 g a 4 °C.
8. Remova o álcool isopropílico (tanto quanto possível) e adicione 1 mL de etanol a 75% frio em H2O tratada com DEPC.
9. Centrifugar a 7500 g durante 5 min a 4 °C.
10. Remova o etanol (tanto quanto possível).
11. Seque o pellet a 42 °C até que o pellet esteja seco.
12. Ressuspenda o pellet em 15 μL de H tratado com DEPC.₂O (ou água livre de RNase).
13. Quantifique o RNA extraído utilizando o espectrofotómetro NanoDrop 1000.

Controlo de Qualidade do RNA

Preparação de Gel

Transfira o volume completo (cerca de 650 μL) da matriz de gel de RNA pequeno para o recipiente superior de um filtro centrífugo.
2. Coloque o filtro de spin numa microcentrífuga e centrifugue durante 15 minutos a 10.000 g.
3. Remova o filtro.
4. Armazene o gel filtrado a 4 °C (até 1 mês).

Preparação da Mistura de Gel-Dye

Concentrado de corante de RNA pequeno Vortex para 10 s e centrifugar.
2. Pipete 2 μL de corante em microtubos de 0,5 mL livres de RNase. A matriz de gel é muito viscosa; portanto, evite a vortexação e pipete lentamente.
Adicione 40 μL de gel filtrado.
4. Misture a solução por pipetagem ou invertendo o frasco até que a mistura esteja homogénea.
Centrifugar o tubo a 13.000 g durante 10 minutos à temperatura ambiente.

Carregamento de Mistura de Gel-Tinta

1. Retire um novo chip de RNA pequeno do seu saco selado.
2. Coloque o chip na estação de preparação do chip.
3. Deixe a mistura de gel e corante equilibrar-se durante 30 minutos à temperatura ambiente antes de usar, protegendo-a da luz.
Pipetar 9 μL da mistura no fundo do poço.
5. Defina o temporizador para 60 s e certifique-se de que o êmbolo está posicionado em 1 mL.
6. Feche a estação de preparação do chip.
7. Pressione o êmbolo da seringa para baixo até que seja segurado pelo chip.
8. Aguarde 60 s e, em seguida, liberte o êmbolo com o mecanismo de libertação do chip.
9. Abra a estação de preparação do chip e pipete 9 μL da mistura de gel e corante em cada um dos poços marcados como "G".

Solução de Condicionamento de RNA Pequeno e Carregamento de Marcadores

1. Pipete 9 μL da solução de condicionamento de RNA pequeno no poço marcado como "CS".
2. Pipete 5 μL do marcador no poço marcado com uma escada e em cada um dos 11 poços de amostra. Não deixe nenhum poço vazio para permitir uma corrida adequada do chip. Adicione 5 μL de marcador + 1 μL de água deionizada a cada poço de amostra não utilizado.

Carregamento de Amostras

1. Desnaturação por calor da sua amostra a 70 °C durante 2 minutos antes de carregar no chip.
2. Pipete 1 μL da escada no poço marcado com o símbolo da escada.
3. Pipete 1 μL de cada amostra em cada um dos 11 poços de amostra.
4. Coloque o chip horizontalmente no adaptador do misturador de vórtice e misture durante 60 s a 2400 g.
5. Execute a sua amostra no bioanalisador Agilent 2100 dentro de 5 minutos.

Referência:

1. Erika D A, Annamaria M, Giulia S, et al. MicroRNAs Exossomais: Métodos Abrangentes desde a Isolação de Exossomas até a Extração de miRNA e Análise de Pureza[M]//Perfilagem de MicroRNA. Humana, Nova Iorque, NY, 2023: 75-92.