O que é Sequenciação de Ciclo

No domínio da análise genética, o sequenciamento em ciclo emerge como um pico de precisão e eficácia, fornecendo aos investigadores um potente instrumento para desvendar as complexidades embutidas no ADN. Derivado como uma melhoria da técnica convencional de sequenciamento de Sanger, o sequenciamento em ciclo transformou o panorama do sequenciamento genético, facilitando uma análise exaustiva caracterizada por uma precisão e celeridade sem precedentes. Neste discurso, embarcamos numa exploração abrangente do sequenciamento em ciclo, elucidando os seus princípios fundamentais, nuances procedimentais e as suas inúmeras aplicações na esfera da análise genética.

Compreendendo a Sequência de Ciclos: Um Olhar Mais Aprofundado sobre os Princípios Fundamentais

A sequenciação em ciclo epitomiza uma fusão subtil de metodologias de biologia molecular, harmonizando facetas da sequenciação clássica de Sanger com a eficácia inerente à reação em cadeia da polimerase (PCR). No seu cerne, a sequenciação em ciclo procura elucidar o plano genético encapsulado nas moléculas de DNA com um grau de precisão e fidelidade sem igual.

Princípio da Terminação em Cadeia

No cerne da sequenciação por ciclos encontra-se o princípio fundamental da terminação da cadeia, um aspecto fundamental do paradigma de sequenciação de Sanger. Dentro deste quadro, a síntese de DNA encontra interrupções em intervalos precisos ao longo do molde de DNA através da integração de didesoxirribonucleotídeos (ddNTPs). Desprovidos de um grupo 3'-OH, esses ddNTPs impedem a adição subsequente de nucleotídeos pela enzima DNA polimerase, induzindo assim a cessação da síntese de DNA.

Integração do Ciclo de PCR

A característica distintiva que distingue a sequenciação em ciclo da sua contraparte tradicional, a sequenciação de Sanger, é a sua incorporação de ciclos semelhantes aos da PCR. Em contraste com a trajetória linear da síntese de DNA observada na sequenciação de Sanger, a sequenciação em ciclo aproveita o ciclo térmico dentro de um termociclador para orquestrar a desnaturação, anelamento e extensão iterativos de fragmentos de DNA. Esta modalidade cíclica amplifica a eficiência e a resiliência da reação de sequenciação, permitindo assim a aquisição de dados de sequenciação mesmo a partir de quantidades escassas de DNA molde.

Utilização de Polimerase de DNA Termo-Estável

No cerne do sequenciamento em ciclo encontra-se um facilitador fundamental: a utilização de uma polimerase de DNA termoestável, exemplificada pela polimerase Taq. Esta entidade enzimática manifesta uma resiliência excecional a temperaturas elevadas, facilitando assim os ciclos iterativos de desnaturação e síntese intrínsecos ao sequenciamento em ciclo. Além disso, a termoestabilidade inerente à polimerase de DNA mitiga a probabilidade de desnaturação da enzima, protegendo assim a fidelidade da síntese de DNA ao longo de toda a empreitada de sequenciamento.

Rotulagem de Primers de Sequenciação

Mais uma faceta crucial da sequenciação de ciclos diz respeito à rotulagem dos primers de sequenciação, entidades fundamentais que iniciam a síntese de DNA. Convencionalmente, estes primers são marcados com corantes fluorescentes ou isótopos radioativos, facilitando a visualização e deteção dos fragmentos de DNA sintetizados. Através da integração de primers rotulados no ambiente de sequenciação, os investigadores podem decifrar meticulosamente a sequência de nucleotídeos incorporada no molde de DNA.

Separação e Análise de Fragmentos

Após a culminação do procedimento de sequenciação de ciclos, os fragmentos de DNA sintetizados passam por segregação de acordo com o tamanho, utilizando eletroforese capilar ou eletroforese em gel. Subsequentemente, os fragmentos marcados com fluorescência são identificados e analisados, onde cada sinal fluorescente corresponde a um nucleótido distinto assimilado durante a síntese de DNA. Aproveitando algoritmos complexos de análise de dados, os investigadores realizam a tarefa intricada de decifrar a sequência de DNA deduzindo a disposição sequencial dos sinais fluorescentes detetados.

Figura 1 Esquema da reação de sequenciação em ciclo. Os moldes de dupla ou única cadeia são submetidos a um ciclo de reação a três temperaturas, consistindo em desnaturação a alta temperatura, anelamento de primers e extensão/terminação de primers (Keith Kretz, et al., 2024)

Sequenciação em Ciclo vs PCR

Tanto a sequenciação por ciclos como a PCR são técnicas de biologia molecular utilizadas na análise de DNA, mas servem a propósitos divergentes e utilizam metodologias distintas. A PCR serve principalmente para amplificar sequências específicas de DNA, facilitando assim a geração de numerosas cópias de uma região alvo de DNA. Por outro lado, a sequenciação por ciclos é direcionada para elucidar a sequência de nucleotídeos de um fragmento de DNA.

Ciclo de Sequenciação vs Sequenciação de Sanger

Sequenciação em ciclo e Sequenciação de Sanger, enquanto ambos pertencem ao reino de Sequenciação de DNA os métodos apresentam distinções nas suas metodologias e abordagens. O sequenciamento Sanger, concebido por Frederick Sanger na década de 1970, representa a modalidade convencional de sequenciamento de DNA, enquanto o sequenciamento em ciclo surge como uma iteração evoluída desta técnica, concebida para aumentar a eficiência e a capacidade de processamento.

Os Passos da Sequenciação Cíclica

Sequenciação em ciclo, uma extensão do clássico Sequenciação de Sanger método, abrange uma série de procedimentos fundamentais destinados à amplificação e sequenciação precisas de fragmentos de DNA.

1. Rotulagem e Preparação de Primers

O passo inicial envolve a rotulagem de primers de sequenciação, meticulosamente desenhados para se ligar à sequência de DNA alvo, instigando assim a síntese de DNA. Na sequenciação em ciclo, os primers são impregnados com um corante fluorescente ou um rótulo radioativo, facilitando a deteção subsequente. Estes primers rotulados passam por uma preparação meticulosa, onde são ligados ao DNA molde de cadeia simples, em conjunto com a presença de uma enzima DNA polimerase e uma mistura de desoxirribonucleotídeos (dNTPs).

2. Ciclo Térmico

Após a fase de anelamento dos primers no DNA molde, a mistura de reação é submetida a um processo conhecido como ciclagem térmica. Este processo crucial abrange uma série regimentada de oscilações de temperatura projetadas para acelerar a desnaturação do DNA, facilitar o anelamento dos primers e estimular a síntese de DNA.

Tipicamente, a mistura de reação é primeiro exposta a uma condição térmica elevada propícia à desnaturação do DNA. Este aumento calculado da temperatura induz a separação do DNA de dupla hélice em cadeias individuais. Subsequentemente, é provocada uma redução da temperatura, promovendo a fase de anelamento dos primers. Durante este último passo, os primers ligam-se seletivamente às suas respetivas sequências complementares presentes no DNA molde.

Por último, um regime de temperatura intermédia é utilizado para iniciar e promover o processo de síntese de DNA. Durante esta fase, a maquinaria enzimática representada pela DNA polimerase estende substancialmente o primer. Este processo de extensão é alcançado através da capacidade inerente da polimerase de incorporar sequencialmente nucleotídeos complementares na cadeia molde, orientando assim a montagem arquitetónica adequada da nova molécula de DNA.

3. Incorporação de Nucleotídeos Terminadores de Cadeia

Com o início da fase de síntese de DNA, uma espécie de nucleotídeos conhecida como didesoxynucleotídeos (ddNTPs), referidos como nucleotídeos terminadores de cadeia, são assimilados no filamento de DNA em desenvolvimento. Estes ddNTPs em particular estão desprovidos de um grupo 3'-OH, um aspecto que impede qualquer continuação subsequente da síntese de DNA após a sua adição à cadeia em expansão. Consequentemente, isso provoca a cessação da síntese de DNA em cada local respectivo de ddNTP, culminando na produção de uma variedade de fragmentos de DNA de comprimentos distintos.

4. Separação e Detecção

Após a culminação das reações termocíclicas, os fragmentos de DNA gerados são distinguidos de acordo com os seus respetivos tamanhos através de modalidades como a eletroforese em gel ou a eletroforese capilar. Após a separação, estes fragmentos são detetados e posteriormente visualizados, seja através da detecção por fluorescência, caso os primers tenham um rótulo fluorescente, ou por meio de autoradiografia se os primers tiverem sido marcados radioativamente. Os dados de sequência resultantes podem então ser analisados para determinar a sequência de nucleotídeos do molde de DNA original.

Ao seguir estes passos procedimentais, a sequenciação em ciclo facilita a sequenciação precisa e eficiente de fragmentos de DNA. Isso torna-a um ativo tecnológico inestimável para a investigação em biologia molecular, práticas de diagnóstico e uma variedade de outras disciplinas científicas.

Protocolo de Sequenciação por Ciclo: Um Procedimento Detalhado

Materiais e Equipamentos

Antes de iniciar o protocolo de sequenciação em ciclo, reúna todos os materiais e equipamentos necessários:

Materiais:

Buffer de rotulagem: 300 mM Tris-HCl, pH 7,8, 50 mM MgCl2, 1 M KCl.

Buffer de diluição de quinase: 50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 25 mM KCl, 5 mM DTT, 0.1 mM ATP, 0.2 mg/mL BSA, 50% glicerol.

Primer de sequencia: Disponível comercialmente, por exemplo, 5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3'.

Adenosina trifosfato rotulado: [γ-32P]ATP (≥ 3000 Ci/mmol, 10 mCi/mL) ou [γ-33P]ATP (1600 Ci/mmol).

Buffer de sequenciação: 300 mM Tris-HCl, pH 9.0, 50 mM MgCl2, 300 mM KCl, 0,5% W-1.

Solução de corante de formamida: 95% de formamida desionizada, 10 mM EDTA, pH 8.0, 0.1% azul de bromofenol, 0.1% cianol de xileno.

Taq DNA polimerase, dNTPs e ddNTPs: Disponíveis comercialmente.

Buffer TE 10X: 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA.

Óleo de silicone leve: Opcional.

Primers de PCR com caudas universais: por exemplo, M13 forward (5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3') e M13 reverse (5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3').

Equipamento:

Ciclador térmico: Capaz de executar ciclos térmicos semelhantes à PCR.

Banhos de água ou blocos de aquecimento: Para manter temperaturas específicas.

Túbulos de microcentrífuga: Polipropileno, 0,2 ou 0,5 mL.

Pipetas automáticas: Capazes de dispensar 0,5–20 µL e 10–100 µL.

Equipamento de eletroforese: Para Sequenciação de DNA.

Filme de raios X: Lado único com uma base azul.

Procedimento

Passo 1: Rotulagem de Primers

Diluia o primer de sequencia para 0,5 pmol/µL com tampão TE 1X.

Misture 2 µL do primer diluído, 1 µL do tampão de rotulagem, 2 pmol de ATP rotulado e 1 µL de quinase de polinucleotídeos T4 num tubo de microcentrífuga.

Incube a reação a 37°C durante 10 minutos, seguido de 55°C durante 5 minutos.

Coloque o tubo em gelo molhado para terminar a reação.

Passo 2: Preparação de Misturas de Reação

Prepare uma mistura pré-reação combinando 5 µL de primer marcado na extremidade, 4,5 µL de tampão de sequenciação, 7–26 µL de DNA molde, 0,5 µL de Taq DNA polimerase e água destilada autoclavada até um volume total de 36 µL.

Divida a mistura de pré-reação em quatro tubos de microcentrífuga rotulados A, C, G e T.

Passo 3: Sequenciação de Reações

Prepare misturas de sequenciação de acordo com a Tabela 1.

Adicione 10 µL da mistura de sequenciação apropriada a cada tubo de microcentrífuga rotulado.

Tampe os tubos de forma segura e misture suavemente.

Se estiver a usar um ciclista térmico sem tampa aquecida, adicione 20 µL de óleo de silicone a cada reação.

Inicie o ciclo térmico com o seguinte programa:

3 minutos a 95°C para desnaturação.

20 ciclos de desnaturação a 95°C durante 30 s, anelamento a 55°C durante 30 s e extensão a 70°C durante 60 s.

10 ciclos adicionais de desnaturação a 95°C durante 30 s e extensão a 70°C durante 60 s.

Passo 4: Análise

Termine as reações adicionando 5 µL da solução de corante de formamida a cada tubo.

Misture bem e centrifugue brevemente.

Armazene os tubos de reação a -20°C até à análise.

Separe os produtos da reação num gel de sequenciação e visualize utilizando filme de raios X.

Aplicações da Sequenciação de Ciclos

Investigação de Doenças Genéticas

A sequenciação em ciclo é fundamental na investigação de doenças genéticas, pois facilita a determinação precisa das sequências de ADN ligadas a distúrbios hereditários. Por exemplo, Ng et al. (2010) utilizaram a sequenciação em ciclo para descobrir novas mutações no gene PANK2, implicado na neurodegeneração associada à quinase do pantotenato (PKAN), uma doença neurodegenerativa rara. Através da sequenciação dos segmentos codificantes do gene PANK2 em indivíduos afetados, os investigadores identificaram mutações missense que prejudicavam a funcionalidade da proteína, aumentando assim a compreensão das bases genéticas do PKAN (Ng et al., 2010).

Microbiologia Ambiental

No âmbito da microbiologia ambiental, a sequenciação em ciclo serve como um método fundamental para delinear comunidades microbianas e o seu repertório de genes funcionais em diversos ecossistemas. Por exemplo, Liu et al. (2018) utilizaram a sequenciação em ciclo de genes 16S rRNA para analisar a diversidade e composição microbiana em amostras de solo provenientes de várias categorias de uso do solo. Através da sequenciação de fragmentos amplificados por PCR de genes 16S rRNA, os investigadores discerniram alterações na arquitetura da comunidade microbiana em diferentes padrões de uso do solo, iluminando assim as repercussões das práticas de gestão do solo sobre os agrupamentos microbianos do solo (Liu et al., 2018).

Genómica do Cancro

A técnica de sequenciação em ciclo encontra utilidade no vasto campo da genómica do cancro, onde é utilizada para descobrir mutações somáticas e alterações genómicas associadas, fundamentais para a tumorigénese e a progressão subsequente. Isto é eloquentemente destacado no estudo seminal realizado por Imielinski et al. (2012), onde a aplicação concertada da sequenciação em ciclo desvendou o panorama mutacional do adenocarcinoma pulmonar. Através de uma sequenciação metódica de amostras de DNA tumoral e normal correspondentes, os investigadores conseguiram identificar mutações recorrentes em certos genes, nomeadamente EGFR, KRAS e TP53. Esta revelação forneceu pistas importantes sobre os mecanismos moleculares que influenciam a patogénese do cancro do pulmão (Imielinski et al., 2012).

Análise Forense

Na ciência forense, a sequenciação em ciclo é uma técnica fundamental para o perfilamento de ADN e análise forense, permitindo a identificação de indivíduos através das suas assinaturas genéticas. Por exemplo, Budowle et al. (2003) utilizaram a sequenciação em ciclo para analisar locos de repetições em tandem curtas (STR) para o perfilamento de ADN forense. Ao sequenciar fragmentos de STR amplificados por PCR extraídos tanto de evidências da cena do crime como de amostras de referência, os investigadores conseguiram corresponder perfis de ADN, contribuindo assim de forma significativa para investigações criminais e para a dispensa de justiça (Budowle et al., 2003).

A utilidade da sequenciação em ciclo abrange diversos domínios, encapsulando um espectro de esforços de investigação biológica e aplicações no mundo real. Desde desvendar as bases genéticas de doenças até delinear comunidades microbianas e perfilar DNA forense, a sequenciação em ciclo surge como uma ferramenta versátil para gerar informações precisas sobre sequências de DNA. As suas aplicações multifacetadas contribuem significativamente para o avanço do conhecimento em genética, microbiologia, oncologia e ciência forense, enriquecendo assim a nossa compreensão destes complexos domínios científicos.

Expansão da Oferta de Serviços: Incorporação de Sequenciamento Sanger e Sequenciamento de Nova Geração

Ao explorar as complexidades da contribuição do sequenciamento em ciclo para a análise genética, é imperativo contextualizar a sua importância no panorama das metodologias de sequenciamento. Embora o sequenciamento em ciclo sirva como um método fundamental, oferecendo uma análise de DNA meticulosa e expedita, a sua eficácia é aumentada e harmonizada pelas funcionalidades inerentes a ambos. Sequenciação de Sanger e Sequenciação de Nova Geração (NGS).

Sequenciação de Sanger: Uma Fundação de Precisão

Sequenciação de Sanger, creditado ao trabalho pioneiro de Frederick Sanger, perdura como o método quintessencial em Sequenciação de DNA devido à sua meticulosa elucidação de sequências de nucleotídeos. Ao empregar a terminação estratégica da síntese de DNA utilizando ddNTPs terminadores de cadeia, o sequenciamento de Sanger capacita os investigadores a discernir sequências genéticas com uma precisão sem igual. A sua metodologia focada revela-se especialmente vantajosa na validação de variantes genéticas e no sequenciamento de regiões designadas com a máxima fidelidade.

Sequenciação de Nova Geração: Revolucionando a Análise Genética

Na vanguarda da genómica de alto rendimento, NGS as tecnologias revolucionaram a nossa metodologia na análise genética. Através da paralelização das reações de sequenciação e da utilização de plataformas pioneiras, o NGS facilita a elucidação genómica rápida e exaustiva numa magnitude anteriormente inconcebível com técnicas de sequenciação convencionais. Abrangendo desde a sequenciação do genoma completo até à metagenómica e à transcriptómica, o NGS capacita os investigadores a explorar as complexidades do genoma com uma profundidade e amplitude sem igual.

Integração nas Ofertas de Serviços

Em consonância com o nosso compromisso com uma investigação minuciosa através do sequenciamento cíclico, a nossa instalação agora alarga o seu âmbito para incluir Sequenciação de Sanger e NGSEsta estratégia holística garante aos investigadores acesso a um repertório variado de metodologias de sequenciação, cada uma dotada de capacidades e utilidades distintas. Seja para desvendar as bases genéticas de doenças, caracterizar populações microbianas ou perfilar ADN forense, o nosso portefólio de serviços aprimorado equipa os investigadores com as ferramentas e competências necessárias para navegar com destreza nas complexidades da análise genética.

Referências:

1. Ng, J., Papandreou, A., Heales, S. J., Kurian, M. A. (2010). Distúrbios dos neurotransmissores monoaminérgicos—Avanços clínicos e perspetivas futuras. Nature Reviews Neurologia, 6(12), 705-715.
2. Liu, J., Sui, Y., Yu, Z., Shi, Y., Chu, H., Jin, J., ... & Wang, G. (2018). O conteúdo de carbono do solo impulsiona a distribuição biogeográfica das comunidades fúngicas na zona de solo negro do nordeste da China. Biologia e Bioquímica do Solo, 121, 103-108.
3. Imielinski, M., Berger, A. H., Hammerman, P. S., Hernandez, B., Pugh, T. J., Hodis, E., ... & Garraway, L. A. (2012). Mapeamento das características do adenocarcinoma pulmonar com sequenciação massivamente paralela. Célula, 150(6), 1107-1120.
4. Budowle, B., Moretti, T. R., Baumstark, A. L., Defenbaugh, D. A., Keys, K. M., & Brown, A. L. (2003). Validação de repetições em tandem curtas (STRs) para uso forense: Testes de desempenho de sistemas STR multiplex fluorescentes e análise de amostras forenses autênticas e simuladas. Revista de Ciências Forenses, 48(4), 928-956.
5. Blakesley, R.W. (2001). Sequenciação de Ciclos. In: Graham, C.A., Hill, A.J.M. (eds) Protocolos de Sequenciação de DNA. Métodos em Biologia Molecular
6. Surdhar, G.K. (2002). Sequenciação Cíclica de Produtos de PCR. In: Theophilus, B.D.M., Rapley, R. (eds) Protocolos de Detecção de Mutação por PCR. Métodos em Biologia Molecular, vol 187. Humana Press.