Sequenciação de RNA Direcionada: Desvendando os Princípios de Detecção, Fluxo de Trabalho e Diversas Aplicações

RNA-sequma tecnologia de análise de sequenciamento de transcriptoma possibilitada por sequenciação de alto rendimento, inicialmente focado no estudo dos níveis de expressão e diferenças de mRNA, pequenos RNAs e RNAs não codificantes. Na última década, tem assistido a um desenvolvimento notável e agora é amplamente aplicado em cenários como análise de variação de transcrição, deteção de fusões genéticas e identificação de splicing alternativo. RNA-seq direcionado, em contraste, foca na análise de transcritos específicos. Semelhante ao RNA-seq padrão, utiliza métodos de enriquecimento direcionado para avaliação da expressão génica, análise de espécies de RNA, deteção de fusões génicas e mutações. No entanto, supera o RNA-seq padrão em termos de sensibilidade, faixa dinâmica, custo-efetividade e rendimento.

O que é RNA-seq direcionado?

A sequenciação de RNA direcionada representa uma técnica de sequenciação de alto rendimento. O seu objetivo é analisar transcritos de RNA específicos para detectar fenómenos como fusões genéticas, mutações, variações de splicing e expressões específicas de fenótipos. Ao amplificar seletivamente o cDNA da região alvo, reduz os custos e o tempo de sequenciação em comparação com a sequenciação de RNA de todo o transcriptoma, ao mesmo tempo que aumenta a sensibilidade e a especificidade dos experimentos. As principais características da sequenciação de RNA direcionada são as seguintes:

Seleção de seletividade de região-alvoA RNA-seq direcionada amplifica seletivamente a região de RNA alvo através de sondas de captura (como sondas oligonucleotídicas marcadas com biotina) ou primers específicos. Esta abordagem permite a análise aprofundada de genes específicos, transcritos ou famílias de genes.

Sensibilidade e especificidadeDevido ao seu foco em regiões específicas, o RNA-seq direcionado apresenta uma maior sensibilidade na deteção de genes de baixa abundância, genes de fusão raros ou variações específicas de splicing. Por exemplo, na leucemia mieloide aguda (LMA), pode revelar fusões genéticas que são difíceis de detectar por métodos tradicionais.

Deteção de fusões genéticasEsta técnica é amplamente utilizada na investigação do câncer, particularmente em malignidades hematológicas, para detectar eventos de fusão de genes. Por exemplo, pode identificar a fusão do gene CRLF2 na B-ALL semelhante ao Ph.

Deteção de mutações e variações de splicingA RNA-seq direcionada é capaz de detectar mutações pontuais, inserções ou deleções, e variações de splicing complexas.

Análise de expressão específica de fenótipoAo analisar os padrões de expressão de RNA em tipos celulares ou tecidos específicos, o RNA-seq direcionado contribui para desvendar os mecanismos moleculares subjacentes às doenças.

É importante notar que, embora o RNA-seq direcionado seja uma ferramenta poderosa para uma análise de RNA altamente sensível e específica em áreas de pesquisa específicas, a sua aplicação deve ser adaptada às necessidades de pesquisa específicas. A sua combinação com outras tecnologias, como o RNA-seq de transcriptoma completo, pode resultar em resultados mais abrangentes.

RNA-Seq direcionado por captura de alvo (Hrdlickova et al., 2016)

O Princípio do RNA-seq Direcionado

A sequenciação de RNA direcionada é um método de análise do transcriptoma baseado em tecnologia de sequenciação de alto rendimento, que visa cobrir profundamente e analisar com precisão a região do gene ou RNA de interesse através de estratégias experimentais e de design específicas. O seu princípio básico é o seguinte.

Seleção da região-alvo e design da sondaPrimeiro, é necessário identificar a região alvo de RNA a ser sequenciada. Estas regiões são geralmente transcritos de genes, RNA não codificante, etc., relacionados a problemas biológicos ou doenças específicas. De acordo com a sequência de nucleotídeos da região alvo, é projetada uma sonda específica complementar a ela. As sondas são geralmente moléculas de DNA ou RNA de cadeia simples, e o comprimento varia geralmente de dezenas a centenas de pares de bases. Elas podem ligar-se especificamente à sequência de RNA alvo. Para facilitar a operação subsequente, a sonda pode ser marcada com etiquetas especiais, como a biotina.

Extração e fragmentação de RNAO RNA total é extraído de amostras biológicas (como células e tecidos) para garantir que o RNA extraído tenha alta integridade e pureza. Em seguida, são utilizados métodos físicos (como tratamento ultrassónico) ou métodos enzimáticos (como ribonuclease) para cortar o RNA em fragmentos de tamanho apropriado, geralmente entre 100 a 500 bases de comprimento, de modo a facilitar as reações subsequentes de hibridação e sequenciação.

Captura por hibridizaçãoHibridize o RNA fragmentado com a sonda desenhada. Sob temperatura e concentração de sal apropriadas, a sonda irá ligar-se especificamente ao fragmento de RNA alvo com uma sequência complementar para formar um híbrido RNA-sonda. Os fragmentos de RNA não-alvo permanecem em estado livre, sem se ligar à sonda. Para melhorar a eficiência e especificidade da hibridização, alguns reagentes que promovem a hibridização, como a formamida, são geralmente adicionados ao sistema de hibridização.

EnriquecimentoHíbridos de RNA-prova são separados do sistema misto utilizando rótulos especiais marcados nas provas e técnicas de captura correspondentes. Por exemplo, se a prova estiver marcada com biotina, podem ser utilizadas esferas magnéticas de estreptavidina para a captura. A estreptavidina tem uma forte afinidade com a biotina, que pode ligar-se especificamente ao híbrido de RNA-prova marcado com biotina, e então as esferas magnéticas e os fragmentos de RNA-alvo ligados a elas são separados por força magnética para enriquecer o RNA-alvo e remover uma grande quantidade de RNA não-alvo.

Construção de biblioteca e sequenciaçãoA construção da biblioteca foi realizada com os fragmentos de RNA alvo capturados e enriquecidos. Geralmente, inclui a adição de sequências de ligadura específicas em ambas as extremidades dos fragmentos de RNA para que estes se possam combinar com os primers da plataforma de sequenciação. Em seguida, a biblioteca foi amplificada por PCR para aumentar a quantidade de RNA alvo para a sequenciação subsequente. Finalmente, a biblioteca construída é carregada na plataforma de sequenciação de alto rendimento para sequenciação, e a informação da sequência de RNA é determinada pela deteção do sinal de cada base, de modo a obter os dados de sequência detalhados da região de RNA alvo para uma análise bioinformática posterior, como a análise de expressão génica e deteção de mutações.

RNA-Seq direcionado por sequenciação de amplicões (Hrdlickova et al., 2016)

Como Funciona o RNA-seq Direcionado

A sequenciação de RNA direcionada geralmente inclui preparação de amostras, construção de bibliotecas, sequenciação e análise de dados. A seguir, uma introdução detalhada.

Preparação de amostras

• Coleta de amostras: Selecione amostras biológicas apropriadas, como sangue, tecidos e células, de acordo com o objetivo da pesquisa. Assegure-se de que o processo de coleta de amostras esteja em conformidade com as especificações para manter a integridade e a atividade biológica do RNA.
• Extração de RNA: O RNA total é extraído da amostra por métodos apropriados, como o método TRIzol e o método de esferas magnéticas. Após a extração, a integridade do RNA é verificada por eletroforese em gel de agarose ou bioanalisador, e a concentração e pureza do RNA são determinadas por espectrofotometria para garantir que cumpra os requisitos dos experimentos subsequentes.
• Fragmentação de RNA: Métodos físicos, como tratamento ultrassónico, ou métodos enzimáticos, como a RNase, são utilizados para cortar o RNA em fragmentos de tamanho apropriado, sendo o comprimento dos fragmentos geralmente de cerca de 100-500 bp.

Construção de biblioteca

• Hibridização de sondas: Projetar e sintetizar uma sonda específica para a região de RNA alvo, e hibridizá-la com o RNA fragmentado sob condições específicas, de modo que a sonda possa ligar-se especificamente à sequência complementar do RNA alvo.
• Captura e enriquecimento: O fragmento de RNA alvo ligado à sonda é capturado utilizando biotina e outros marcadores presentes na sonda, e o RNA não ligado e as impurezas são removidos através de lavagem e outras operações para realizar o enriquecimento do RNA alvo.
• Transcrição reversa: A transcriptase reversa e os primers são adicionados ao RNA alvo enriquecido, e o cDNA é sintetizado com o RNA como molde.
• Adicionar ligadores: Adicione sequências de ligadores específicas em ambas as extremidades do cDNA para fornecer locais de ligação para a amplificação e sequenciação subsequentes por PCR.

Amplificação por PCR: O cDNA com ligador é amplificado por reação de PCR para aumentar o número de sequências-alvo para análise de sequenciamento subsequente.

Sequenciação

• Sequenciação em linha: A biblioteca construída é carregada numa plataforma de sequenciação de alto rendimento, como Illumina e PacBio, e sequenciada de acordo com os respetivos princípios e processos de sequenciação para gerar um grande número de dados de sequenciação originais.

Análise de dados

• Pré-processamento de dados: Controlo de qualidade dos dados de sequenciação originais, remoção de sequências de baixa qualidade, sequências de ligadura, etc., para melhorar a precisão e fiabilidade dos dados.
• Comparação e anotação: Compare os dados processados com o genoma ou transcriptoma de referência, determine a posição de cada sequência no genoma e faça a anotação genética para identificar a informação específica do gene e do transcrito do RNA alvo.
• Análise diferencial: De acordo com o objetivo da pesquisa, a expressão diferencial de genes entre diferentes amostras foi analisada para identificar os genes diferencialmente expressos e explorar mais a fundo os genes e vias-chave relacionados a doenças ou processos biológicos.

Visão geral do fluxo de trabalho de preparação de bibliotecas de amplicões competitivos e análise de dados (Blomquist et al., 2013)

As Vantagens e Desvantagens do RNA-seq Direcionado

Como uma tecnologia de sequenciação importante, a sequenciação de RNA direcionada é amplamente utilizada em biologia e investigação médica. A seguir estão as suas vantagens e desvantagens.

Vantagens

• Alta sensibilidade e especificidadeA sequenciação de RNA direcionada pode fornecer uma maior profundidade de sequenciação e sensibilidade ao capturar especificamente as moléculas de RNA alvo, especialmente para a deteção de transcritos de baixa abundância. Por exemplo, no diagnóstico de malignidades hematológicas, a sequenciação de RNA direcionada pode identificar marcadores clinicamente relevantes (como LSC177 ou pLSC632) e detetar mutações somáticas adquiridas.
• Custo-efetividadeA sequenciação de RNA direcionada reduz o custo da sequenciação ao diminuir a quantidade de RNA não alvo sequenciado. Por exemplo, o método de preparação da biblioteca de amplificação por PCR multiplex competitiva pode manter a consistência entre diferentes datas, preparação de bibliotecas e laboratórios, ao mesmo tempo que reduz significativamente os custos.
• Reduzir a interferência de fundoA sequenciação de RNA direcionada evita o problema da ligação de sondas não específicas ou da hibridação cruzada de sondas, reduzindo assim a interferência de fundo. Além disso, ao otimizar o design, os sinais falsos positivos podem ser reduzidos.
• Flexibilidade e adaptabilidadeA plataforma de sequenciação de RNA direcionada é altamente adaptável e pode ser integrada nos pipelines de triagem da Qualcomm e no desenvolvimento de compostos para estudar a expressão de proteínas de stress em vias de sinalização específicas.
• Adequado para amostras complexasA sequenciação de RNA direcionada apresenta um bom desempenho em amostras complexas (como sangue e tecidos tumorais) e pode detectar transcritos de fusão, mutações genéticas e saltos de exões.

Desvantagens

• Falta de complexidade no designA sequenciação de RNA direcionada requer primers e sondas cuidadosamente desenhados para garantir a captura específica do RNA alvo. Isso pode exigir conhecimento e experiência profissionais.
• Cobertura limitadaA sequenciação de RNA direcionada geralmente apenas sequencia moléculas de RNA específicas ou regiões de genes, pelo que não consegue cobrir totalmente todo o grupo de transcrição. Isso pode resultar na omissão de genes ou transcritos que não são capturados pelo alvo.
• Limitação técnicaA sequenciação de RNA direcionada pode ser afetada pela variação da amplificação por PCR, especialmente na preparação da biblioteca de amplificação por PCR multiplex, onde diferentes alvos podem ser enviesados devido à diferença na eficiência de amplificação. Além disso, algumas técnicas (como a redução de ruído de código de barras molecular) são raramente utilizadas na sequenciação direcionada porque podem introduzir interferências não específicas.
• Interpretação de dados complexosA interpretação dos dados de sequenciação de RNA direcionada precisa ser combinada com conhecimentos biológicos de fundo para distinguir sinais reais de potencial ruído técnico. Por exemplo, ao detectar RNA de recém-nascidos, este pode ser afetado pela degradação do RNA durante a imunoprecipitação.
• Âmbito de aplicação limitadoA sequenciação de RNA direcionada é mais adequada para estudar problemas biológicos específicos ou mecanismos de doenças do que a análise genómica abrangente. Por exemplo, na análise microbiana, o método de sequenciação do genoma completo pode ser mais adequado para a estimativa da abundância de espécies.

A sequenciação de RNA direcionada é uma tecnologia eficiente, económica e sensível, adequada para a investigação de moléculas de RNA específicas e diagnóstico de doenças. No entanto, a sua complexidade de design, cobertura limitada e limitações técnicas são os principais desafios a serem superados.

Representação esquemática de como a preparação de bibliotecas de amplicões competitivos reduz a superamostragem (Blomquist et al., 2013)

Aplicações do RNA-seq direcionado

A sequenciação de RNA direcionada é uma tecnologia de análise do transcriptoma de alta precisão, que pode detectar e quantificar de forma eficiente os genes de interesse, enriquecendo ou amplificando o RNA em regiões genómicas específicas. Esta tecnologia tem sido amplamente utilizada em muitos campos, incluindo investigação do cancro, desenvolvimento de medicamentos, neurogenómica e diagnóstico clínico.

Investigação sobre o câncer

A sequenciação de RNA direcionada tem aplicações importantes na investigação do câncer, especialmente na deteção de fusões de genes tumorais, mutações genéticas e análise de perfis de expressão.

• Deteção de fusões de genes tumorais: O sequenciamento de RNA direcionado pode identificar parceiros de fusão de genes conhecidos e desconhecidos, especialmente em amostras de tecido fixo (como FFPE). Este método pode encontrar genes de fusão raros causados por translocações recessivas ou microdeleções, proporcionando assim novos alvos para o tratamento do câncer.
• Análise da heterogeneidade do câncer: A tecnologia de sequenciação de RNA direcionada pode revelar a heterogeneidade dentro do tumor e ajudar a compreender a complexidade e a resposta ao tratamento do tumor.
• Deteção precoce do câncer: O sequenciamento de RNA direcionado melhora a sensibilidade e a precisão da deteção precoce do câncer ao enriquecer RNA não codificante de cadeia longa (lncRNA).

Extração de RNA e preparação de template em câncer (Hong et al., 2020)

Desenvolvimento de medicamentos

A sequenciação de RNA direcionada desempenha um papel importante no desenvolvimento de medicamentos. Pode determinar com precisão regiões específicas de RNA, ajudar a selecionar alvos para fármacos, avaliar a eficácia dos medicamentos ao analisar as alterações de RNA antes e depois da ação do fármaco, e também identificar as características do RNA relacionado à resistência a medicamentos, o que fornece uma base fundamental para otimizar fármacos e prever riscos de resistência a medicamentos, acelerando assim o processo de investigação e desenvolvimento de medicamentos seguros e eficazes.

• Regulação da expressão génica: Através da sequenciação de RNA direcionada, os investigadores podem analisar as alterações na expressão génica das células após o tratamento com fármacos e identificar potenciais alvos terapêuticos.
• Construção de modelo de doença: Usando a tecnologia de sequenciação de RNA da Qualcomm, podemos estabelecer um modelo de heterogeneidade tumoral a partir de pacientes para a previsão da resposta a medicamentos.

Neurogenómica

A sequenciação de RNA direcionada é amplamente utilizada na investigação do neurogenoma. Pode focar com precisão na transcrição de genes relacionados com os nervos, revelar as diferenças na expressão génica e anomalias na splicing alternativa no desenvolvimento nervoso e em doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer, através da análise de sequências de RNA específicas, e ajudar a analisar o mecanismo das doenças nervosas e explorar potenciais alvos terapêuticos.

• Pesquisa sobre desenvolvimento neural: Ao analisar o transcriptoma das células nervosas, podemos revelar o padrão de expressão génica no processo de desenvolvimento neural.
• Estudo sobre o mecanismo das doenças neurológicas: O sequenciamento de RNA direcionado pode ajudar a identificar a expressão gênica anormal relacionada a doenças neurológicas e fornecer pistas para o diagnóstico e tratamento das doenças.

Visão geral da abordagem utilizada para analisar RNA para auxiliar no diagnóstico da disferlinopatia (Rufibach et al., 2023)

Diagnóstico clínico

A sequenciação de RNA direcionada é amplamente utilizada no diagnóstico clínico, podendo detectar com precisão os transcritos de genes relacionados com tumores e auxiliar na triagem precoce, tipificação e avaliação do prognóstico do câncer. Pode identificar o RNA patogénico e ajudar no diagnóstico rápido de doenças infeciosas; também pode ser utilizada para detectar variações de RNA relacionadas com doenças genéticas, fornecendo uma base fundamental para o diagnóstico clínico, formulação de planos de tratamento e monitorização da doença.

• Deteção de genes de fusão: Através de sequenciação de RNA direcionada, genes de fusão em malignidades hematológicas, como LSC17 ou P63LSC2, podem ser detetados, fornecendo assim suporte para o diagnóstico clínico.
• Diagnóstico de doenças raras: O sequenciamento de RNA direcionado pode ser utilizado para identificar os genes patogénicos de doenças raras e ajudar no diagnóstico e tratamento através da análise dos padrões de expressão de genes específicos.

Estudo de Caso de RNA-seq Direcionado em Fusão de Genes

Os genes de fusão podem levar a sequências anormais ou a proteínas funcionais, ou ao desequilíbrio da expressão de alguns genes, e, em seguida, levar ou promover a ocorrência de tumores. Relata-se que a incidência de câncer humano causado por genes de fusão é de cerca de 20%. No entanto, a prevalência de genes de fusão varia bastante entre diferentes tipos de câncer, e muitos genes de fusão são específicos de subtipos de câncer específicos. Portanto, a identificação rápida e precisa de genes de fusão pode diagnosticar o câncer de forma qualitativa e hierárquica.

O RNA foi extraído das linhas celulares K562 e RDES, e comparado com RNA-seq convencional através de RNA-seq direcionado. Os resultados mostraram que a abundância de ERCC na sequenciação de RNA-seq direcionado foi 59 vezes (painel de sangue) e 33 vezes (painel de tumor sólido) superior à da sequenciação de RNA-seq convencional, e a entrada mínima da sequenciação de captura direcionada foi de 3pM. Isto demonstra que ambos os painéis na sequenciação de RNA direcionada têm uma forte capacidade de captura.

Os investigadores avaliaram a fiabilidade do gene de fusão detetado por dois painéis. Os resultados mostraram que a uniformidade de cobertura do transcrito do Painel em tumores hematológicos e tumores sólidos era boa, e a cobertura dos locais de splicing conhecidos foi de 77,8% e 84,6%, respetivamente. Isto demonstra que ambos os Painéis em sequenciação por captura direcionada de RNA têm a capacidade de detetar a maioria dos genes de fusão.

O estudo também comparou a deteção de genes de fusão de baixa cópia entre RNA-seq direcionado e RNA-seq convencional. Os resultados mostraram que não houve diferença significativa entre os dois métodos na deteção de BCR-ABL1 (8-24 cópias de DNA) na linha celular K562. No entanto, quando EWSR1-FLI1 (cópia única de DNA) foi detetado na linha celular RDES, a sequenciação de RNA-seq convencional não foi coberta por leituras no início do local de fusão. Isso mostra que a sequenciação por captura direcionada de RNA tem vantagens óbvias sobre a sequenciação de RNA-seq convencional na deteção de genes de fusão de baixa abundância.

Visão geral da RNA-seq direcionada e validação de painel (Heyer et al., 2019)

Conclusão

A sequenciação de RNA direcionada, como um meio poderoso para estudar com precisão RNA específico, possui um princípio único. Em primeiro lugar, desenha sondas complementares de acordo com a região de RNA alvo, que podem ligar-se especificamente ao RNA alvo como uma "navegação precisa". O RNA da amostra é extraído, fragmentado e hibridizado com a sonda, e então o híbrido RNA-sona alvo é capturado e enriquecido pelo marcador. Depois, a biblioteca é construída e sequenciada para realizar a sequenciação profunda da região de RNA alvo. As suas vantagens são óbvias. Comparado com a sequenciação do transcriptoma completo, pode focar mais em regiões chave, com menor custo e maior profundidade de sequenciação, o que é conveniente para a deteção precisa de RNA de baixa abundância. No entanto, também tem limitações, sendo apenas para áreas alvo conhecidas, e pode perder novos transcritos ou variações.

Na área da aplicação, o sequenciamento de RNA direcionado é amplamente utilizado. Na investigação científica, ajuda a explorar as funções dos genes e revela o seu papel nos processos biológicos ao detectar com precisão a expressão de genes específicos. Na área médica, pode ser utilizado para diagnóstico de doenças e avaliação do prognóstico, como o sequenciamento direcionado de genes relacionados com tumores, assistindo no diagnóstico precoce e monitorização de doenças tumorais. Também pode ser utilizado na investigação e desenvolvimento de medicamentos. Ao monitorizar as alterações do RNA alvo sob a ação de medicamentos, a eficácia e a potencial toxicidade podem ser avaliadas, fornecendo suporte de dados chave para o desenvolvimento de novos fármacos.

Referências:

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