Como Analisar Dados de Sequenciação de Amplicon: Ferramentas, Dicas e Pipelines

Sequenciação de amplicões é agora uma pedra angular de perfilamento microbiano e análise genética direcionada, valorizada pela sua precisão e eficiência de custos. Este método oferece uma forma simplificada de examinar regiões específicas do DNA com alta resolução, desde estudos do microbioma intestinal até avaliações da biodiversidade ambiental e descoberta de biomarcadores de doenças.

No entanto, o sucesso técnico depende de mais do que apenas sequenciamento. Insights fiáveis dependem de quão bem os dados são processados - desde as verificações de qualidade iniciais até à classificação taxonómica e comparação estatística. Este guia delineia um quadro passo a passo para analisar dados de sequenciamento de amplicões utilizando ferramentas confiáveis como QIIME2, DADA2 e LEfSe.

Quer esteja a ser um cientista de investigação a validar alterações microbianas ou um parceiro de CRO a fornecer insights genómicos, este artigo oferece dicas práticas e estratégias de design de pipeline que apoiam resultados robustos e reproduzíveis.

Introdução à Sequenciação de Amplicons

Amplificação Direcionada: Uma Abordagem Inteligente para Sequenciação Focada

Sequenciação de amplicons tornou-se um método preferido para analisar regiões específicas do DNA com alta precisão e eficiência. Em vez de sequenciar um genoma inteiro, esta técnica amplifica seletivamente regiões-alvo usando primers cuidadosamente desenhados. Estes primers ligam-se às áreas adjacentes de interesse, permitindo que a reação em cadeia da polimerase (PCR) gere múltiplas cópias desses fragmentos.

Este método direcionado oferece vantagens claras:

• Suporta sequenciação de alto rendimento a um custo mais baixo do que abordagens mais amplas, como a metagenómica.
• Fornece informações profundas sobre a variação genética dentro de loci específicos.
• Reduz o ruído de fundo, ajudando os investigadores a entender o que é mais importante.

A sequenciação de amplicões tornou-se uma ferramenta padrão na investigação do microbioma. Ao focar no gene 16S rRNA em bactérias ou na região ITS em fungos, os cientistas podem identificar com precisão quais micróbios estão presentes e em que proporções. Quer estejam a estudar o intestino humano, solos agrícolas ou sistemas aquáticos, este método revela a diversidade microbiana que sustenta a saúde, a doença e a função dos ecossistemas.

Para uma visão detalhada dos princípios e do fluxo de trabalho do sequenciamento de amplicões 16S/18S/ITS, pode consultar este recurso: Princípios e Fluxo de Trabalho do Sequenciamento de Amplicões 16S/18S/ITS

Sequenciação de Amplicon vs. MetagenómicaQual Deveria Usar?

Embora ambos os métodos tenham valor, eles servem a propósitos diferentes. Aqui está como eles se comparam:

• Custo: O sequenciamento por amplicon é geralmente mais económico porque se concentra em regiões específicas e menores do DNA. A metagenómica requer o sequenciamento de todo o material genético, o que é mais intensivo em recursos.
• Volume de Dados: Os conjuntos de dados metagenómicos são massivos e fornecem visões abrangentes da função da comunidade. Os dados de amplicão são mais enxutos, mas ideais para perfilagem taxonómica.
• Âmbito da Aplicação:
• Utilize a sequenciação de amplicons quando o seu objetivo for a estrutura ou diversidade da comunidade microbiana.
• Escolha metagenómica se precisar de explorar o potencial metabólico ou genes funcionais.

Por exemplo, um estudo de Zhang et al. (2019) utilizou sequenciação de amplicões do gene 16S rRNA para investigar a diversidade microbiana em várias amostras de solo, revelando estruturas comunitárias distintas influenciadas por fatores ambientais. Por outro lado, Ye et al. (2012) utilizaram sequenciação metagenómica para analisar comunidades microbianas em bioreatores de tratamento de águas residuais, descobrindo genes funcionais associados a processos de remoção de nutrientes. Estes estudos exemplificam como a escolha entre sequenciação de amplicões e metagenómica depende dos objetivos da pesquisa - seja focando no perfil taxonómico ou no potencial funcional.

Figura 1. A abundância relativa dos filos bacterianos do solo dominantes varia entre diferentes tipos de terreno. Os dados refletem a composição da comunidade baseada em OTUs. Adaptado de Zhang et al., 2017.

Para uma comparação aprofundada destes métodos, considere ler este artigo: O Fluxo de Trabalho e as Aplicações da Sequenciação de Amplicões

Pré-processamento de Dados

Passo Um: Verificar a Qualidade dos Dados com o FastQC

Antes de prosseguir com qualquer análise subsequente, é essencial avaliar a qualidade dos dados brutos. Uma das ferramentas mais utilizadas para isso é o FastQC, que oferece uma visão rápida e intuitiva das leituras de sequenciamento.

Os principais indicadores incluem:

• Pontuação Phred: Isto mede a probabilidade de erros na chamada de bases. Uma pontuação acima de Q20 ou Q30 é geralmente considerada de alta qualidade.
• Conteúdo de GC: Sequências com conteúdo de GC anormal podem indicar contaminação ou viés de sequenciação. O FastQC gera gráficos de GC para ajudar a identificar tais anomalias.

Estes diagnósticos ajudam os investigadores a identificar leituras de baixa qualidade precocemente, evitando erros que poderiam distorcer os resultados mais tarde. Um estudo sobre o microbioma intestinal humano publicado na Microbiome utilizou o FastQC para sinalizar e remover leituras de baixa confiança com base nas métricas Phred e GC, melhorando a fiabilidade dos dados antes da profilagem taxonómica.

Os módulos de controlo de qualidade integrados oferecem funcionalidades semelhantes para os utilizadores que trabalham no ambiente QIIME2. Estes incluem fluxos de trabalho básicos de corte e filtragem, tornando o QIIME2 uma opção conveniente para o pré-processamento de ponta a ponta.

Passo Dois: Cortar, Filtrar e Limpar os Seus Dados

Uma vez que tenha avaliado a qualidade, o próximo passo é limpar as sequências brutas. Esta etapa envolve normalmente:

• Corte de extremidades de baixa qualidade: Ferramentas como o DADA2 utilizam modelos estatísticos para inferir sequências biológicas reais e remover erros de sequenciação. O DADA2 é particularmente eficaz na identificação de substituições de bases e indels.
• Remoção de primers: Se os primers permanecerem nas leituras, podem interferir na agrupamento preciso. O Cutadapt é uma ferramenta flexível e eficiente que procura e remove essas sequências de primers indesejadas.
• Filtragem de quimeras: Quimeras são construções de DNA artificiais formadas durante a PCR. Elas não refletem a verdadeira biologia e devem ser eliminadas. O UCHIME ajuda a detectar estas comparando as leituras a bases de dados de referência confiáveis.

Um estudo amplamente citado por Callahan et al. demonstrou um fluxo de trabalho robusto utilizando DADA2 para desruído, Cutadapt para remoção de primers e UCHIME para filtragem de quimeras, permitindo um perfilamento preciso de comunidades microbianas em diversas amostras humanas e ambientais.Métodos da Natureza, 2016, doi:10.1038/nmeth.3869).

Para uma compreensão aprofundada destes passos de pré-processamento, consulte este recurso: Análise de Sequenciamento de Amplicon: OTU vs. ASV

Alinhamento de Sequências e Agrupamento

Da Semelhança às Espécies: Agrupamento Baseado em OTU

Agrupar sequências de ADN semelhantes é uma pedra angular da análise de sequenciamento de amplicons. Tradicionalmente, isso tem sido feito usando Unidades Taxonómicas Operacionais (OTUs) - grupos de sequências que partilham um nível definido de similaridade, tipicamente 97%.

As ferramentas populares para agrupamento de OTUs incluem:

• UCLUST, que utiliza um algoritmo ganancioso para ordenar sequências por comprimento e agrupá-las com base em limiares de similaridade.
• O Mothur oferece várias estratégias de agrupamento (por exemplo, vizinho médio ou vizinho mais distante) para ajustar o agrupamento com base em objetivos ecológicos.

O limiar de 97% de semelhança é amplamente aceito porque as bactérias que partilham este nível de semelhança nos seus genes 16S rRNA são frequentemente consideradas da mesma espécie. Este limiar encontra um equilíbrio entre a sobre-segmentação e a agregação excessiva.

Por exemplo, Barberán et al. aplicaram a clustering baseada em OTU para analisar comunidades microbianas em 151 amostras de solo coletadas de diversos ecossistemas dos EUA. Ao identificar redes de coocorrência e gradientes ambientais, revelaram como as populações microbianas mudam em resposta a fatores como pH e aridez. Revista ISME.doi: 10.1038/ismej.2011.119)

ASVs: Maior Resolução, Maior Precisão

Os Variantes de Sequência de Amplicon (ASVs) surgiram como uma alternativa mais precisa aos OTUs. Ao contrário dos OTUs, que dependem de um limite de similaridade fixo, os ASVs capturam sequências biológicas reais com resolução de um único nucleótido - sem agrupamento.

Dois algoritmos de ASV líderes são:

• DADA2, que utiliza um modelo de erro paramétrico para corrigir erros de sequenciação e inferir sequências reais.
• UNOISE3, um método não paramétrico que filtra o ruído com base em padrões de abundância de leituras. É comumente utilizado dentro dos frameworks USEARCH ou UPARSE.

O benefício? Resolução a nível de estirpe. ASVs permitem distinguir entre variantes microbianas que se fundiriam com métodos baseados em OTU.

Num estudo de grande impacto publicado na Cell, Wastyk et al. (2021) acompanharam como as intervenções dietéticas modulam o microbioma intestinal humano. Usando uma análise baseada em ASV, os investigadores detetaram alterações subtis, a nível de estirpes, na composição microbiana associadas a uma dieta rica em fibras ou a uma dieta de alimentos fermentados - diferenças que os métodos tradicionais baseados em OTU provavelmente perderiam. Estas perceções detalhadas ligaram alterações microbianas específicas à modulação imunológica, enfatizando o poder do perfilamento do microbioma em alta resolução.

Figura 1. A diversidade do microbioma intestinal aumentou significativamente nos participantes que seguiram uma dieta rica em alimentos fermentados, conforme demonstrado pela análise a nível de ASV. Adaptado de Wastyk et al., 2021.

Para uma introdução abrangente aos ASVs e suas vantagens, pode explorar este recurso: Introdução aos Variantes de Sequência de Amplicon.

Atribuição Taxonómica

Escolhendo a Base de Dados e Classificador Certos para Resultados Fiáveis

Uma vez que as sequências são desruídas e agrupadas, o próximo passo é determinar "quem está lá" na amostra. Isso é feito através da atribuição taxonómica, onde as leituras de DNA são comparadas a táxons microbianos conhecidos utilizando bases de dados curadas e algoritmos de classificação.

Três bases de dados de referência comumente utilizadas incluem:

• Silva: Atualizado anualmente, o Silva oferece uma ampla cobertura de bactérias, arqueias e micróbios eucariotos, tornando-o ideal para estudos taxonómicos abrangentes.
• Greengenes: Embora historicamente popular para a análise de 16S rRNA, o Greengenes não foi atualizado desde 2013. O seu uso está agora principalmente limitado a pipelines legados.
• RDP (Projeto de Base de Dados Ribossómica): Conhecido pelas suas ferramentas fáceis de usar e atualizações frequentes, o RDP é benéfico tanto para tarefas de classificação de bactérias como de fungos.

No QIIME2, o plugin q2-feature-classifier é a ferramenta ideal para atribuição de taxonomia. Ele utiliza um algoritmo de classificação bayesiana que calcula a probabilidade de uma sequência específica pertencer a um táxon específico com base na similaridade de sequência e nas probabilidades taxonómicas anteriores da base de dados de referência.

Uma comparação de referência publicada na Nature Microbiology avaliou múltiplas combinações de bases de dados e classificadores. O estudo constatou que o desempenho variava dependendo do tipo de amostra e das necessidades de resolução. A combinação do Silva com o classificador QIIME2 para as comunidades microbianas mais complexas proporcionou a maior precisão tanto a nível de género como de espécie.

Fazendo Sentido dos Perfis Taxonómicos

Uma vez atribuída a taxonomia, os investigadores precisam de interpretar as abundâncias relativas de grupos microbianos em cada amostra. Mas apenas as contagens brutas não são suficientes - a normalização é fundamental para comparações significativas.

Duas metodologias standard para a escalagem de abundância incluem:

• TSS (Escalonamento da Soma Total): Converte contagens em percentagens relativas, dividindo cada valor pelo total de contagens de leitura para essa amostra.
• CSS (Escalonamento de Soma Cumulativa): Ajusta a variação entre amostras e profundidades de sequenciação, oferecendo melhor controlo sobre o viés em estudos de alta capacidade de análise.

Os dados taxonómicos podem ser explorados em múltiplos níveis - filo, classe, género e além. Cada camada oferece uma visão diferente:

Os padrões a nível de filo fornecem uma visão geral ampla (por exemplo, a dominância de Firmicutes e Bacteroidetes em amostras intestinais).

Os insights a nível de género ajudam a identificar organismos específicos ligados a doenças, metabolismo ou funções ambientais.

O Projeto do Microbioma Humano, apresentado na Science, demonstrou como o perfilamento taxonómico em múltiplos níveis pode revelar assinaturas microbianas distintas em diferentes locais do corpo. Esta abordagem em camadas ajudou os investigadores a mapear associações entre a microbiota e os resultados de saúde, estabelecendo a base para os estudos clínicos sobre o microbioma atualmente.

Visualização e Interpretação

Visualização da Comunidade Microbiana

Transformar a Diversidade Beta em Insights Acionáveis

Uma vez gerados os perfis microbianos, o próximo desafio é dar sentido aos dados. É aqui que a visualização entra em cena. Ao mapear as estruturas das comunidades em visuais intuitivos, os investigadores podem descobrir padrões que de outra forma estariam ocultos em números brutos.

Duas ferramentas amplamente utilizadas para comparar a diversidade microbiana entre amostras são:

• PCoA (Análise de Coordenadas Principais): Este método linear projeta amostras em um espaço de dimensão inferior com base em métricas de distância par a par, como Bray-Curtis ou Jaccard. Num gráfico de PCoA, amostras que se agrupam de forma próxima são composicionalmente semelhantes - ideal para comparar tratamento vs. controlo ou tipos de solo.
• NMDS (Escalonamento Multidimensional Não Métrico): Ao contrário do PCoA, o NMDS preserva a ordem de classificação das distâncias, tornando-o mais robusto a dados não normais e a outliers. É benéfico em conjuntos de dados de microbioma de alta dimensão e inflacionados por zeros.

Ambas as abordagens oferecem uma visão visual da diversidade beta, ajudando os investigadores a explorar como as comunidades microbianas variam em diferentes condições, pontos no tempo ou locais.

Ferramentas para Dar Vida aos Dados

Plataformas de visualização interativa como iTOL e ImageGP facilitam a interpretação de dados taxonómicos complexos:

• iTOL (Árvore da Vida Interativa): Esta ferramenta baseada em navegador permite aos utilizadores carregar árvores filogenéticas e anotá-las com metadados, genes funcionais ou classificações taxonómicas. É uma favorita para exibir relações evolutivas com gráficos limpos e em camadas.
• ImageGP: Desenvolvido pela equipa de Yong-Xin Liu, o ImageGP suporta visualizações avançadas, como gráficos de barras, gráficos de dispersão e mapas de calor. É benéfico para comparar distribuições de abundância entre grupos de amostras.

A Apresentação Importa: Desenhe Como um Editor de Jornal

A qualidade da apresentação é fundamental se estiver a preparar figuras para publicação, particularmente em revistas de alto impacto como a Nature Ecology & Evolution. Tenha em mente estas melhores práticas:

• Utilize formatos baseados em vetor (por exemplo, SVG ou PDF) para visuais nítidos.
• Selecione paletas amigáveis para daltónicos para melhorar a acessibilidade.
• Assegure-se de que todos os eixos, legendas e agrupamentos estejam claramente rotulados.
• Mantenha alta resolução (300 dpi+) para saídas impressas e digitais.

Em resumo, um gráfico bem concebido faz mais do que parecer bom - comunica a história por trás dos seus dados.

Estruturas de Análise Estatística

Identificação de Diferenças Significativas Entre Grupos Microbianos

Uma vez que as comunidades microbianas são perfiladas e visualizadas, o próximo passo é determinar quais táxons diferem realmente entre os grupos. É aqui que os quadros de análise estatística entram em cena, ajudando os investigadores a passar da observação para a compreensão biológica.

Três ferramentas amplamente utilizadas na análise de sequenciação de amplicões incluem:

• LEfSe (Análise de Discriminante Linear do Tamanho do Efeito): O LEfSe identifica táxons diferencialmente abundantes ao combinar o teste de Kruskal-Wallis com a análise de discriminante linear (LDA). Primeiro, detecta características estatisticamente significativas e, em seguida, classifica-as pelo tamanho do efeito, destacando quais grupos microbianos estão mais associados a cada condição.
• ANCOM (Análise da Composição de Microbiomas): Ao contrário dos métodos tradicionais que ignoram o viés composicional, o ANCOM considera a natureza relativa dos dados de abundância microbiana. É particularmente útil para conjuntos de dados com inflação de zeros (muitos zeros) e táxons raros, tornando-se uma escolha robusta para comparações clínicas ou ambientais.
• PERMANOVA (Análise de Variância Multivariada por Permutação): A PERMANOVA avalia se a estrutura geral da comunidade difere entre grupos, com base em uma matriz de distâncias. É não paramétrica e ideal para dados microbianos, que frequentemente violam as suposições de normalidade.

Juntos, estas ferramentas formam um poderoso conjunto de ferramentas para descobrir diferenças biológicas significativas - não apenas ruído estatístico.

Estudo de Caso: Ligação entre Alterações no Microbioma e Doença

Um estudo de Wu et al. (2022) investigou os efeitos da metformina na microbiota intestinal em um modelo de rato com distúrbio do metabolismo glicolipídico induzido por dieta rica em gordura. Utilizando análises LEfSe, ANCOM e PERMANOVA, os pesquisadores identificaram alterações significativas na composição e função microbiana associadas ao tratamento com metformina. Estas descobertas destacam a utilidade de estruturas estatísticas abrangentes na identificação de táxons microbianos ligados a intervenções terapêuticas.

Conclusão e Melhores Práticas

Construção de Pipelines Reproduzíveis de Sequenciação de Amplicões

Em projetos de sequenciação microbiana, a reprodutibilidade não é opcional - é essencial. Quer esteja a trabalhar na academia ou a apoiar um pipeline clínico, garantir que outros possam replicar os seus resultados constrói confiança e credibilidade científica.

Duas plataformas amplamente utilizadas para análises reproduzíveis são o QIIME2 e o Mothur. Ambas oferecem fluxos de trabalho padronizados - mas a reprodutibilidade depende de mais do que a escolha da ferramenta. Requer:

• Rastreamento de versões: Registe sempre a versão exata do software utilizado. No QIIME2, inclua a versão nos cabeçalhos dos seus scripts ou na documentação.
• Isolamento do ambiente: Utilize ambientes Conda para gerir dependências. Isto evita conflitos e garante resultados consistentes, mesmo meses ou anos depois.

Num estudo recente publicado na iMeta, os investigadores demonstraram o valor destas práticas. Ao combinar um controlo de versões rigoroso com a gestão de ambientes baseada em Conda no QIIME2, conseguiram reproduzir com sucesso a sua análise da comunidade microbiana em execuções independentes - um modelo de melhores práticas na investigação em ómicas.

Evitando Armadilhas Comuns na Análise de Amplicões

Mesmo com as ferramentas certas, a sequenciação de amplicons pode resultar em resultados enganosos se certas armadilhas não forem evitadas. Aqui estão três áreas-chave onde os erros costumam ocorrer - e como preveni-los:

• Viés de seleção de primers
• Um mau design de primers pode distorcer os resultados ao amplificar alguns táxons enquanto ignora outros. Para evitar isso:
• Utilize primers degenerados para aumentar a inclusividade do alvo.
• Valide múltiplos conjuntos de primers antes de execuções em grande escala.
• Inconsistências na base de dados
• As classificações taxonómicas podem variar consoante a versão da base de dados. Para uma atribuição precisa:
• Utilize a versão mais recente da sua base de dados escolhida (por exemplo, Silva, RDP).
• Documentar claramente a versão utilizada em todos os relatórios e publicações.
• Evite recursos desatualizados - o Greengenes não foi atualizado desde 2013.
• Métricas de diversidade inadequadas
• Nem todos os índices de diversidade são criados iguais. Escolha com base no seu objetivo de pesquisa:
• O índice de Shannon reflete tanto a riqueza como a uniformidade - adequado para comparações gerais.
• A Diversidade Filogenética (PD) de Faith considera as relações evolutivas - ideal quando a filogenia é importante.

Ao gerir proativamente estas questões, os investigadores podem aumentar dramaticamente a fiabilidade, precisão e interpretabilidade dos dados da sua comunidade microbiana.

Referências:

1. Wastyk HC, Fragiadakis GK, Perelman D, et al. Dietas direcionadas à microbiota intestinal modulam o estado imunológico humano. Cell. 2021;184(16):4137-4153.e14. DOI: 10.1016/j.cell.2021.06.019
2. Zhang, J., Liu, Y., Zhang, X., et al. (2019). Abordagens de quantificação bacteriana do solo em combinação com abundâncias relativas que refletem as mudanças de táxons. Scientific Reports, 9, 11076. Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça-o aqui e terei prazer em ajudar com a tradução.
3. Ye, L., Zhang, T., Wang, T. T., & Fang, Z. W. (2012). Estruturas microbianas, funções e vias metabólicas em biorreatores de tratamento de águas residuais reveladas através de sequenciação de alto rendimento. Ciência e Tecnologia Ambiental, 46(24), 13244-13252. DOI: 10.1021/es303454k
4. Wu, H., Wang, X., Fang, X., et al. (2022). A metformina modula o microbioma intestinal num modelo de ratos com distúrbio do metabolismo glicolipídico induzido por dieta rica em gordura. Fronteiras em Microbiologia, 13, 1001234. Desculpe, não posso acessar ou traduzir conteúdo diretamente de links. Se você puder fornecer o texto que deseja traduzir, ficarei feliz em ajudar!