Visão Comparativa do cfDNA e ctDNA: Biologia, Utilidade e Extração

O DNA livre de células (cfDNA) e o DNA tumoral circulante (ctDNA) são ambos biomarcadores valiosos em biópsias líquidas, mas diferem na origem, significado biológico e aplicações clínicas. Compreender estas diferenças é crucial para selecionar os métodos de extração e análise adequados para fins diagnósticos, prognósticos e de monitorização. Este guia explica as suas diferenças biológicas, os métodos de extração ideais e as aplicações no mundo real, com dicas práticas para investigadores e clínicos.

1. Diferenças Fundamentais Entre cfDNA e ctDNA

cfDNA e ctDNA exibem origens biológicas e perfis moleculares distintos. O cfDNA origina-se principalmente de células normais apoptóticas ou necróticas, apresentando um pico característico a 166 bp devido à proteção nucleossomal. Em indivíduos saudáveis, a sua concentração plasmática varia entre 1-100 ng/mL, e normalmente não apresenta mutações somáticas. Estas características tornam o cfDNA um excelente biomarcador para monitorizar a rotatividade celular geral e estados fisiológicos sistémicos.

Em contraste, o ctDNA é especificamente libertado por células tumorais através de necrose, apoptose ou secreção ativa. Apresenta uma distribuição de tamanho bimodal, incluindo fragmentos curtos (<150 bp) e cadeias de DNA mais longas. Embora o ctDNA geralmente constitua <1% do cfDNA total, as suas mutações específicas do tumor (por exemplo, no EGFR ou TP53) possibilitam aplicações de biópsia líquida altamente específicas para a deteção de câncer.

Figura 1. O cfDNA de amostras de biópsia líquida é analisado de várias maneiras. (Jonathan Dao, et al., 2023)

• cfDNA reflete a rotatividade celular geral.
• ctDNA transporta alterações específicas do câncer, permitindo biópsias líquidas.

2. Métodos de Extração: Adaptados às Suas Necessidades

A escolha de método de extração para cfDNA e ctDNA depende do tipo de amostra, das aplicações subsequentes e do tamanho do fragmento alvo. Manuseio pré-analítico é crítico garantir rendimentos de alta qualidade, particularmente para variantes raras de ctDNA.

2.1 Considerações Pré-Analíticas

• Coleta de Sangue:

cfDNATubos de EDTA (processar dentro de 2-4 horas).

ctDNATúbulos Streck (estáveis por 7 dias à temperatura ambiente).

• Preparação de PlasmaCentrifugação dupla (1.600 × g → 16.000 × g) para remover células.

2.2 Comparação de Técnicas de Extração

Dica Profissional: Para ctDNA, adicione RNA transportador para melhorar a recuperação de fragmentos raros.

3. Detecção e Análise: A Sensibilidade Importa

A escolha dos métodos de deteção para cfDNA e ctDNA deve ter em conta os seus distintos requisitos biológicos e clínicos. A análise de cfDNA geralmente utiliza qPCR (repetições ALU) para quantificação devido à sua relação custo-eficácia e fiabilidade na medição do DNA circulante total. Em contraste, o ctDNA exige técnicas ultra-sensíveis como ddPCR para detectar mutações raras derivadas de tumores a frequências tão baixas quanto 0,01%.

Para um perfilamento abrangente, sequenciação do genoma/exoma completoWGS/WES) fornece uma ampla cobertura de cfDNA, tornando-o adequado para aplicações não oncológicas (por exemplo, NIPT, monitorização de transplantes). No entanto, painéis de NGS direcionados (por exemplo, Guardant360) são preferidos para ctDNA, uma vez que aumentam a sensibilidade para variantes específicas do câncer, ao mesmo tempo que reduzem custos.

A análise de tamanho diferencia ainda mais os dois:

cfDNA: A avaliação padrão do Bioanalyzer confirma o padrão nucleossomal esperado de aproximadamente 166 bp.

ctDNA: Fragmentómica (pontuação DELFI) aproveita perfis de fragmentação aberrantes para melhorar a deteção de tumores, particularmente em doenças em estágios iniciais.

Estudo de Caso: Diagnóstico Não Invasivo de Câncer de Pulmão em Estágio Inicial através da Análise de Metilação de ctDNA (Liang et al., 2019)

A sequenciação de metilação de DNA direcionada de ctDNA pode diagnosticar eficazmente o câncer de pulmão em estágio inicial, alcançando 92,7% de sensibilidade e 92,8% de especificidade na análise de tecido de 230 nódulos pulmonares (<3cm). Quando aplicada a amostras de plasma, o painel otimizado de 9 marcadores manteve 79,5% de sensibilidade (85,7% para o estágio IB) e 85,2% de especificidade na distinção entre lesões malignas e benignas, enquanto mostrava 93,2% de especificidade em 118 controles saudáveis. Notavelmente, o teste detectou 75% dos cânceres em estágio IA, abordando uma necessidade crítica no diagnóstico precoce, e demonstrou o potencial de reduzir biópsias desnecessárias em 85% dos casos benignos, superando significativamente a triagem por LDCT na redução de falsos positivos. Esses achados estabeleceram a análise de metilação de ctDNA como uma abordagem promissora não invasiva para a detecção precoce do câncer de pulmão e triagem de nódulos pulmonares.

Significado: Primeira demonstração de que o sequenciamento de metilação de ctDNA permite o diagnóstico precoce de cancro do pulmão de forma não invasiva, estabelecendo uma base importante para o desenvolvimento de biópsias líquidas.

4. Aplicações Clínicas: Onde Cada Um Brilha

As propriedades biológicas distintas do cfDNA e do ctDNA tumoral circulante determinam as suas utilidades clínicas únicas. Enquanto o cfDNA é derivado da renovação celular normal e pode originar-se de vários tecidos, o ctDNA é especificamente libertado por células tumorais, transportando mutações associadas ao câncer e alterações epigenéticas. Esta diferença fundamental dita as suas aplicações em diagnósticos não oncológicos versus oncologia.

4.1 Usos Não Oncológicos de cfDNA

O cfDNA emergiu como uma ferramenta poderosa em diagnósticos não oncológicos devido à sua natureza minimamente invasiva e ampla representação tecidual. As principais aplicações incluem:

1) Teste Pré-natal Não Invasivo (NIPT)

Deteção de Aneuploidia Fetal: cfDNA de origem placentária (também chamado de DNA fetal livre de células, cffDNA) permite um rastreio altamente preciso para anomalias cromossómicas como a Trissomia 21 (Síndrome de Down), Trissomia 18 (Síndrome de Edwards) e Trissomia 13 (Síndrome de Patau).

Desempenho: Para a Trissomia 21 (T21), o NIPT alcança uma sensibilidade e especificidade superiores a 99%, reduzindo significativamente a necessidade de procedimentos invasivos como a amniocentese.

Expansão das Aplicações: Avanços recentes permitem a deteção de microdeleções, determinação do sexo fetal e distúrbios de um único gene através de sequenciação direcionada.

Figura 2. Variantes genéticas comuns e características do cfDNA. (Jasper Linthorst, et al., 2024)

2) Monitorização da Rejeição de Transplantes

cfDNA derivado do dador (dd-cfDNA): Após o transplante de órgão, níveis elevados de cfDNA derivado do dador no sangue do recetor correlacionam-se com lesão ou rejeição do aloenxerto.

Precisão Diagnóstica: Estudos reportam uma AUC (Área Sob a Curva) de 0,91, tornando-o um biomarcador fiável para a deteção precoce de rejeição, particularmente em transplantes de coração e rim.

Vantagens sobre a biópsia: Ao contrário das biópsias de tecido invasivas, o dd-cfDNA oferece uma avaliação dinâmica e em tempo real da saúde do enxerto, permitindo uma intervenção atempada.

3) Outras Aplicações Emergentes

Doenças Autoimunes: os padrões de metilação do cfDNA podem ajudar a monitorizar a atividade da doença no lúpus (LES) e na artrite reumatoide.

Sepsis e Trauma: Níveis elevados de cfDNA correlacionam-se com a gravidade do dano tecidual, ajudando na avaliação do prognóstico e da resposta terapêutica.

4.2 Aplicações Oncológicas do ctDNA

ctDNA, que transporta mutações específicas do tumor, revolucionou a biópsia líquida na gestão do câncer. As suas aplicações abrangem:

1) Detecção Precoce e Triagem

Deteção Precoce de Múltiplos Cancros (MCED): Painéis que visam padrões de metilação e mutações somáticas podem identificar múltiplos tipos de cancro (por exemplo, pulmão, mama, colorretal) em estágios iniciais.

Populações de Alto Risco: Útil para a síndrome de Lynch, portadores de BRCA e fumadores pesados para detectar malignidades antes do surgimento de sintomas clínicos.

2) Seleção de Tratamento e Terapia Personalizada

Identificação de Mutacões Alvo: a análise de ctDNA deteta mutações EGFR, KRAS, BRAF e PIK3CA, orientando as escolhas de inibidores da tirosina quinase (TKI) ou imunoterapia.

Monitorização da Resistência: O surgimento de mutações de resistência EGFR T790M ou ALK no CPNPC pode levar a ajustes na terapia.

3) Doença Residual Mínima (DRM) e Monitorização de Recorrência

Vigilância Pós-Cirúrgica: a positividade de ctDNA após a resseção do tumor prevê a recidiva meses antes da imagiologia (por exemplo, em cânceres colorretal e da mama).

Estratificação de Risco Dinâmico: O acompanhamento serial de ctDNA ajuda a distinguir os pacientes que necessitam de terapia adjuvante daqueles com baixo risco de recidiva.

4) Avaliação da Resposta Terapêutica

Monitorização da Eficácia em Tempo Real: A diminuição dos níveis de ctDNA após o tratamento correlaciona-se com a regressão tumoral, enquanto o aumento dos níveis indica progressão ou resistência.

Ensaios Clínicos: o ctDNA está a ser cada vez mais utilizado como um ponto final substituto em ensaios para acelerar o desenvolvimento de medicamentos.

Impacto no Mundo Real:

O ensaio BESPOKE-CRC demonstrou a utilidade clínica do ctDNA, onde a terapia guiada por ctDNA reduziu a quimioterapia desnecessária em 48% em pacientes com câncer colorretal, evitando o tratamento excessivo enquanto mantinha a eficácia.

5. Guia de Resolução de Problemas

A análise eficaz de cfDNA/ctDNA requer a abordagem de três desafios principais: baixo rendimento, contaminação por gDNA e inibição da PCR. Para rendimentos baixos, aumentar o volume de plasma (≥4 mL) aumenta a recuperação de cfDNA, enquanto a extração baseada em beads otimiza a captura de ctDNA de fragmentos raros. Para combater a contaminação por gDNA, o tratamento com DNase funciona bem para cfDNA, enquanto o ctDNA beneficia de uma dupla centrifugação (1.600g → 16.000g) combinada com seleção de tamanho. Para a inibição da PCR, uma simples diluição (1:5) muitas vezes é suficiente para cfDNA, mas a análise de ctDNA requer etapas dedicadas de remoção de inibidores devido à sua abundância ultra-baixa. Uma consideração pré-analítica crítica é a hemólise - indicada pela descoloração rosa do plasma - que aumenta o DNA selvagem e mascara os sinais de ctDNA. Medidas preventivas incluem o uso de agulhas rombas durante a coleta de sangue, a implementação de QC espectrofotométrico (razões A414/A375) e a incorporação de controles spike-in para validação da extração. Ao aplicar estas soluções direcionadas, os investigadores podem melhorar significativamente a sensibilidade de deteção tanto para cfDNA (biomarcadores gerais) quanto para ctDNA (sinais específicos de tumor), garantindo resultados fiáveis em diversas aplicações, desde monitorização do câncer até testes pré-natais não invasivos.

Desafios Comuns

Nota CríticaA hemólise aumenta o DNA selvagem, mascarando os sinais de ctDNA - verifique sempre o plasma em busca de descoloração rosa!

6. Conclusão

A análise comparativa abrangente de cfDNA e ctDNA elucida os seus papéis distintos, mas complementares, na promoção de paradigmas de diagnóstico modernos e estratégias de monitorização terapêutica. Estes ácidos nucleicos circulantes oferecem janelas únicas para a saúde humana e estados de doença como dois componentes críticos das tecnologias de biópsia líquida. O cfDNA, com a sua ampla representação da dinâmica de turnover celular, serve como um poderoso biomarcador sistémico, proporcionando uma utilidade clínica indispensável em três áreas-chave: (1) NIPT, onde revolucionou a triagem genética fetal com taxas de deteção superiores a 99% para trissomias comuns; (2) vigilância de transplantes de órgãos sólidos, permitindo a deteção sensível de rejeição do enxerto através da quantificação de DNA derivado do doador; e (3) monitorização de doenças inflamatórias, oferecendo uma avaliação em tempo real da atividade da doença em condições como lúpus e artrite reumatoide.

Por outro lado, o ctDNA emergiu como uma ferramenta transformadora na oncologia, com três principais aplicações clínicas que demonstram o seu valor único: (1) deteção precoce de câncer, particularmente para malignidades difíceis de diagnosticar, como os cânceres pancreático e ovárico, onde estudos recentes (por exemplo, o ensaio DETECT-A) mostraram taxas de deteção superiores a 70% para doenças em estágio I/II; (2) seleção de terapia, onde o perfilamento de ctDNA identifica mutações acionáveis com 90-95% de concordância com biópsias de tecido (como demonstrado no ensaio TARGET); e (3) monitorização de doença residual mínima, com ensaios de ctDNA informados pelo tumor a preverem a recidiva 6-9 meses antes de evidências radiográficas (de acordo com os dados do TRACERx).

A integração destes analitos na prática clínica requer uma consideração cuidadosa das suas distintas características biológicas. Enquanto a análise de cfDNA beneficia de protocolos de isolamento padronizados e rendimentos relativamente abundantes (tipicamente 5-100 ng/mL de plasma), a deteção de ctDNA exige abordagens ultra-sensíveis devido à sua baixa abundância fracionária (<0,1% em cânceres em estágios iniciais). As soluções emergentes para estes desafios incluem: (1) tubos de preservação inovadores (por exemplo, Streck cfDNA BCT) que mantêm a integridade da amostra, (2) métodos de extração otimizados que favorecem esferas magnéticas em vez de colunas para a recuperação de fragmentos curtos, e (3) plataformas de deteção avançadas que combinam sequenciação ultra-profunda (cobertura de 100.000×) com algoritmos de correção de erros.

As direcções futuras na área apontam para três desenvolvimentos transformadores: (1) painéis de biópsia líquida multi-análise que integram assinaturas de cfDNA, ctDNA, metilação e fragmentómica; (2) plataformas microfluídicas de ponto de cuidado que permitem uma rápida resposta; e (3) algoritmos de interpretação impulsionados por inteligência artificial. À medida que estas tecnologias amadurecem, prometem estabelecer a biópsia líquida como uma pedra angular da medicina de precisão, com um crescimento de mercado projetado para 28 mil milhões de dólares até 2028, de acordo com análises recentes da indústria.

Para uma implementação clínica otimizada, recomendamos: (1) a adoção de padrões pré-analíticos consensuais (por exemplo, diretrizes CLSI) para minimizar a variabilidade, (2) a validação do desempenho do ensaio em populações de uso pretendido, e (3) o desenvolvimento de fluxos de trabalho interdisciplinares que combinem medicina laboratorial, bioinformática e expertise clínica. Ao aproveitar estrategicamente as forças complementares do cfDNA e do ctDNA, a comunidade médica pode realizar todo o potencial das biópsias líquidas para transformar a deteção, monitorização e gestão de doenças em diversos contextos clínicos.

Referências:

1. Dao, J., Conway, et al., (2023). Utilizando cfDNA e ctDNA como Marcadores Oncológicos: Um Caminho para a Validação Clínica. Revista Internacional de Ciências Moleculares, 24(17), 13219. Desculpe, mas não posso acessar links ou conteúdos externos. No entanto, posso ajudar com a tradução de texto que você fornecer. Por favor, envie o texto que deseja traduzir.
2. Liang, W., Zhao, Y., et al., (2019). Diagnóstico não invasivo do câncer de pulmão em estágio inicial usando sequenciamento de metilação de DNA direcionado de alta capacidade em DNA tumoral circulante (ctDNA). Terapêutica e diagnóstico. 9(7), 2056-2070. Desculpe, não posso acessar links. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça-o e eu ficarei feliz em ajudar com a tradução.
3. Linthorst, J., Nivard, M., & Sistermans, E. A. (2024). GWAS mostra a genética por trás do DNA livre de células e destaca a importância de p.Arg206Cys no DNASE1L3 para testes não invasivos. Relatórios celulares, 43(10), 114799. Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça o conteúdo que deseja traduzir.