Sequenciação de Fagos E. coli: Aplicações e Considerações

O sequenciamento de fagos E. coli é uma ferramenta importante para estudar a interação entre bacteriófagos e bactérias hospedeiras (E. coli). Com o rápido desenvolvimento da tecnologia genómica, o sequenciamento de fagos E. coli não só ajuda os cientistas a compreender as características genéticas dos bacteriófagos, mas também fornece uma nova perspetiva de investigação para a biotecnologia, medicina e proteção ambiental. Este artigo discutirá as aplicações do bacteriófago E., os desafios potenciais e as considerações. Sequenciação de E. coli.

Aplicação Principal

Alvo Genómico de Patógenos Resistentes a Medicamentos

Insights mecanísticos dos fagos de E. coli O157

• Padrões de Infeção Específicos por Grupo: Os isolados do fago T4 formaram três clusters genómicos distintos. Cada cluster exibiu uma infeção preferencial de cepas específicas de PT (por exemplo, os fagos do Grupo 1 lisaram consistentemente variantes PT21/28).
• Correlação Fenótipo-Genótipo: Os perfis de infeção dentro dos clusters mostraram >85% de semelhança, com uma divergência genómica <5% entre os membros do grupo. O Grupo 1 possuía cinco genes únicos que potencialmente governam a especificidade do hospedeiro.
• Implicações do Design de Cocktails
  • Esta agrupamento permite o desenvolvimento racional de cocktails de fagos:
    • Componentes universais: Fagos amplamente ativos entre clusters
    • Componentes específicos: Fagos direcionados a grupos para estirpes resistentes
• Estratégia de Alvo Terapêutico: Variações genéticas mínimas entre os grupos (particularmente nos genes das fibras da cauda) representam alvos de engenharia precisos para um controlo melhorado do alcance do hospedeiro (Cowley LA et al., 2015).

Validação de Candidatos Terapêuticos: Caso do Fago VE20

Perfil de Segurança Genómica

Garantia de Segurança Ambiental

• <75% homologia com portadores de genes de resistência (por exemplo, isolado de esgoto YZ1 com SUL2)
• Risco mínimo de transferência horizontal de genes

Determinantes Moleculares da Eficácia Terapêutica

Expansão do Alcance de Hospedeiros

• As variações do filamento caudal (ORF13-14) permitem a lise de:
  • 47,05% de estirpes clínicas de E. coli
  • Salmonella enterica serovares

Eficiência de Replicação

• Latência curta (10 min): Impulsionada por genes de replicação de DNA (ORF72-73)
• Tamanho de explosão moderado (60 PFU/célula): Módulo de lise simplificado (endolisina única ORF16)

Resiliência Ambiental

• Termostabilidade (30-60°C): Integridade estrutural do capsídeo
• Tolerância de pH (3-11): Adaptações da envoltória do virion (Zhong Z et al., 2024)

A taxa de lise do fago vE20 em diferentes MOI (Zhong Z et al., 2024)

Fago Myoviridae Novo: Caracterização e Potencial Terapêutico

Isolamento e Especificidade do Hospedeiro

O fago VB (GenBank: MT664721), um membro recém-caracterizado da família Myoviridae, demonstra atividade lítica direta contra Escherichia coli APEC O78 resistente a múltiplos fármacos. Este patógeno representa um importante agente de doenças avícolas com um significativo potencial de transmissão zoonótica.

Aplicações Terapêuticas

• Intervenção MDR Direcionada: Terapia de precisão contra infeções por APEC O78 resistentes a fármacos em aves e humanos
  • Espectro Antimicrobiano Ampliado
    • Eficácia preliminar contra patógenos nosocomiais críticos:
    • Acinetobacter baumannii
    • Pseudomonas aeruginosa (Deng S et al., 2021)

Biologia Sintética

Este estudo engenhou com sucesso um fago fluorescente, K1F-GFP, direcionado a Escherichia coli K1 patogénica utilizando a tecnologia CRISPR/Cas. Fornecemos as primeiras informações mecanicistas sobre a sua eficiente eliminação de patógenos intracelulares dentro de células humanas.

1. Avanços na Engenharia de Fagos

• Inserção Gênica Direcionada: Utilizando recombinação homóloga assistida por CRISPR/Cas, o gene GFP foi precisamente integrado numa região não essencial do genoma do fago, resultando num recombinante estável.
• Otimização Funcional do Capsídeo: Defeitos associados à fusão da proteína do capsídeo (por exemplo, redução da aptidão devido a G10::gfp) foram superados através da otimização do design do peptídeo de ligação, permitindo a expressão funcional da proteína fluorescente.

2. Mecanismo Bactericida Intracelular

• Caminho de Co-invasão: O fago K1F-GFP co-entra nas células epiteliais da bexiga humana T24 através da fagocitose juntamente com a sua bactéria hospedeira (E. coli EV36-RFP), confirmado pela co-localização com o marcador fagossomal Rab7.
• Morte Intracelular Aprimorada: K1F-GFP reduz significativamente a carga bacteriana intracelular, demonstrando uma eficiência bactericida >50% superior dentro das células em comparação com o ambiente extracelular. A especificidade foi confirmada pela inatividade do fago T7 e contra bactérias não sensíveis.
• Mecanismos de Degradação:
  • Complexos Fago-Bactéria: Degradados através da fagocitose associada à LC3 (validado pela co-localização com o marcador lisossomal Cathepsina L).
  • Fagos Livres: Sujeitos a um novo caminho de eliminação xenofágica, independente da via de autofagia ubiquitina-NDP52 (Møller-Olsen C et al., 2018).

Fago A221 Microencapsulado Oral: Eficácia Contra a Diarreia em Leitões

Caracterização de Fagos

• Classificação: família Ackermannviridae (subfamília Aglimvirinae, género Agtrevirus)
• Genoma: 153,297 pb dsDNA
• Especificidade do Hospedeiro: Alvos Escherichia coli GXXW-1103
• Eficácia In Vitro: Atividade antibacteriana potente (supressão sustentada ≥16 horas)

Tecnologia de Microencapsulação

• Inovação Fundamental: Formulação resistente ao ácido gástrico protege a viabilidade dos fagos
• Mecanismo de Liberação: Liberação intestinal direcionada

Resultados Terapêuticos In Vivo

Referência Terapêutica

Alcançou uma eficácia equivalente ao antibiótico florfenicol.

Impacto Translacional

• Alternativa aos Antibióticos: Eficaz contra a diarreia induzida por MDR
• Agricultura Sustentável: Permite a transição verde na produção pecuária (Mao X et al., 2023)

Efeitos do fago A221 ou FFC nas bactérias (Mao X et al., 2023)

Fluxo de Trabalho de Sequenciação de Fagos: Estrutura Técnica

1. Processamento de Amostras

• Enriquecimento de Fagos
  • Concentração de vírus: precipitação com PEG8000
  • Purificação: Centrifugação em gradiente de densidade de Iodixanol
• Remoção de DNA Hospedeiro
  • Digestão enzimática: tratamento com DNase I
  • Filtração em bioinformática: Alinhamento contra o genoma de E. coli K-12

2. Preparação de Ácidos Nucleicos

• Extração de DNA
  • Lise do capsídeo: método CTAB
  • Purificação: Cromatografia em coluna com membrana de sílica

3. Estratégia de Sequenciamento

• Abordagem de Dupla Plataforma
  • Leitura curta: Illumina PE150
  • Leitura longa: Oxford Nanopore PromethION

4. Montagem e Polimento Híbrido

• Preparação de Dados de Entrada:
  • Os dados de sequenciação de leitura curta da Illumina servem como entrada para uma montagem de novo usando o SPAdes.
  • Os dados de sequenciação de leitura longa por nanopore servem como entrada para uma montagem de novo utilizando o Flye.
• Polimento de Montagem Híbrida:
  • Os contigs montados tanto do SPAdes (baseado em Illumina) como do Flye (baseado em Nanopore) são combinados.
  • Esses contigs passam por um polimento iterativo com Racon para melhorar a precisão e resolver erros estruturais.
• Saída Final:
  • A montagem polida produz contigs de alta qualidade com um comprimento mínimo superior a 100 quilobases (kb), alcançando uma estatística N50 (uma métrica que indica que metade da montagem está contida em contigs deste tamanho ou maior).
• Tecnologias Chave:
  • SPAdes: Otimizado para leituras curtas da Illumina.
  • Flye: Projetado para leituras longas ruidosas (por exemplo, Nanopore).
  • Racon: Uma ferramenta de consenso que refina montagens utilizando leituras curtas e longas.

5. Anotação Funcional

• Triagem de Duas Bases de Dados
  • PHROGs: Funções principais dos fagos (replicação, embalagem, estrutura)
  • VFDB: Fatores de virulência (por exemplo, toxina Shiga) e genes de resistência (por exemplo, β-lactamases)

Principais Otimizações Técnicas

Para uma abordagem mais detalhada ao sequenciamento de fagos, consulte "Sequenciação do Genoma de Fagos: Métodos, Desafios e Aplicações.

Para mais informações sobre o que é o sequenciamento de fagos, veja "O Que É Sequenciação de Fagos? Um Guia Completo para Investigadores.

Para mais informações sobre o protocolo para Sequenciação do Genoma Lambda, consulte "Sequenciação do Genoma do Fago Lambda: Protocolos e Casos de Uso.

Considerações Principais

1. Controlo das Características Biológicas

• Triagem de Genes de Virulência Obrigatória: Os bacteriófagos que codificam a toxina Shiga (STX1/2) ou a enterotoxina (AstA) devem ser excluídos do uso, independentemente do estado funcional do gene (por exemplo, inativação).
• Adequação de Fagos Industriais: Os fagos destinados a aplicações industriais requerem uma avaliação cuidadosa para eliminar variantes lisogénicas (por exemplo, Lambda *cI+*). Isto previne potenciais eventos de transferência horizontal de genes durante os processos de fermentação.

2. Monitorização Dinâmica da Variação do Alcance de Hospedeiros

Uma estratégia de avaliação periódica, implementada a cada 10 passagens de cultura contínua, é essencial:

• Validação do Intervalo de Hospedeiros através de Assay de Ponto: Detetar alterações nos espectros de lise de fago utilizando uma biblioteca de estirpes hospedeiras padronizada, empregando o método de ensaio de ponto. Quantificar alterações no diâmetro e clareza das placas líticas para avaliar as excursões do intervalo de hospedeiros.
• Análise de Mutação em Todo o Genoma:
  • Executar sequenciação do genoma completo(WGS) na atual geração de fagos.
  • Alinhar sequências ao genoma de referência inicial (por exemplo, usando BWA-MEM + Samtools) para identificar variantes, incluindo:
    • Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e eventos de inserção/deleção (Indels).
    • Variações estruturais (por exemplo, inversões de genes, amplificações de repetições).
    • Eventos de recombinação (visualizados através de alinhamentos genómicos circulares em ferramentas como o BRIG).

3. Implementação Técnica

• Profundidade de Sequenciamento e Controlo de Qualidade:
  • Investigação Básica: Cobertura mínima ≥30x; pontuação Q30 > 90%.
  • Aplicações Clínicas/Industriais: Cobertura mínima ≥50x; requer teste triplo com revisão manual da sequência.
• Controlo de Contaminação:
  • Filtrar todos os reagentes através de uma membrana de 0,22 μm.
  • Incluir controlos sem modelo (NTCs) em todos os procedimentos para detetar e prevenir a contaminação cruzada.

4. Requisitos de Segurança e Conformidade

• Protocolos de Biossegurança:
  • Manipular fagos que transportam fatores de virulência (por exemplo, STX) em laboratórios de Nível de Biossegurança 2 (BSL-2).
  • A libertação ambiental de fagos engenheirados necessita de três barreiras de contenção física, como sistemas fechados de microfluídica.
• Gestão de Propriedade Intelectual:
  • Garanta patentes para componentes principais (por exemplo, a estrutura da proteína GP37 da fibra da cauda do fago JS98).
  • Deposite estirpes de fagos engenheirados de acordo com o Tratado de Budapeste em repositórios internacionais reconhecidos.

Direcções para Avanços Inovadores

1. Monitorização em Tempo Real In Situ

Implementar sequenciação de nanopore direta de amostras de muco intestinal, alcançando resolução de célula única sem enriquecimento prévio. Isso permite a observação em tempo real de interações críticas, como aquelas entre fagos e Clostridioides difficile.

2. Bloqueio Evolutivo da Resistência

Desenvolver fagos assistidos por CRISPR-Cas9. Estes transportam sgRNAs projetadas para direcionar genes de resistência essenciais do hospedeiro (por exemplo, MEFA). Esta estratégia alcança uma inativação de alta eficiência (>98%) dos mecanismos de resistência alvo.

3. Plataforma Microfluídica de Alto Atravésput

Estabelecer sistemas microfluídicos integrados que combinem: seleção de fago único através de rotulagem fluorescente, capacidade de sequenciação paralela em 96 canais e imagem dinâmica de lise em tempo real. Esta plataforma acelera significativamente o processo de triagem para identificar fagos virulentos potentes.

Considerações de Implementação

Fase de Design

• Estado da Bactéria Hospedeira: Otimizar a eficiência da infeção utilizando hospedeiros E. coli na fase de crescimento logarítmico (OD600 = 0,4 ± 0,05).
• Representatividade da Amostra: Para amostras ambientais, utilize estratégias de coleta em múltiplos pontos (por exemplo, em diferentes locais dentro de um fermentador) para minimizar o viés de amostragem.

Fase de Análise de Dados

• Descontaminação: Alinhar obrigatoriamente os dados de sequência contra o genoma de referência E. coli K-12 MG1655 para identificar e remover sequências contaminantes.
• Controlo de Contaminação: Aplique rigorosamente controlos negativos ao longo do fluxo de trabalho para detetar e mitigar potenciais problemas de contaminação cruzada.

Conclusão

Sequenciação de fago E. coli a tecnologia possui um potencial transformador em terapias médicas direcionadas, vigilância da segurança alimentar e aplicações de biologia sintética. O seu sucesso requer atenção simultânea à precisão técnica (montagem híbrida, profundidade de sequenciamento suficiente), protocolos rigorosos de biossegurança (por exemplo, revisão dupla para genes de virulência) e adequação específica à aplicação (por exemplo, exclusão de lisógenos em ambientes industriais). A integração do sequenciamento em tempo real por nanoporo com edição dinâmica baseada em CRISPR está prestes a acelerar avanços na superação de bactérias resistentes a medicamentos, remodelando fundamentalmente o panorama da engenharia microbiana de precisão.

Referências:

1. Cowley LA, Beckett SJ, Chase-Topping M, Perry N, Dallman TJ, Gally DL, Jenkins C. Análise do sequenciamento do genoma completo para os fagos de tipagem de Escherichia coli O157:H7. BMC Genómica. 2015 Abr 8;16(1):271.
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3. Deng S, Xu Q, Fu Y, Liang L, Wu Y, Peng F, Gao M. Análise Genómica de um Novo Fago que Infecciona o Patógeno da Peru Escherichia coli APEC O78 e a Sua Atividade de Endolisina. Vírus31 de maio de 2021; 13(6): 1034.
4. Møller-Olsen C, Ho SFS, Shukla RD, Feher T, Sagona AP. Fagobactérias K1F engenheiradas matam Escherichia coli K1 intracelular em células epiteliais humanas.. Sci Rep. 3 de Dezembro de 2018; 8(1):17559.
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