Sequenciação do Genoma do Fago Lambda: Protocolos e Casos de Uso

O bacteriófago Lambda é um vírus capaz de infectar E. coli. O seu genoma é ADN de cadeia dupla linear, com cerca de 48,5 kb, e contém cerca de 50 genes. A estrutura do seu genoma é simples e tem uma forte adaptabilidade. É frequentemente utilizado em investigação de clonagem de genes, expressão de genes e edição do genoma.

O fago Lambda é um vírus clássico amplamente utilizado em biologia molecular, genómica e investigação em engenharia genética. Lambda sequenciação do genoma de fago A tecnologia tornou-se uma ferramenta importante para estudar as características e funções deste fago e a sua aplicação em experimentos de biologia molecular. Nesta revisão, iremos apresentar em detalhe os protocolos comuns e os casos de aplicação do sequenciamento do genoma do fago Lambda.

Fluxo de Trabalho Experimental

Passo 1: Preparação da Amostra e Extração de DNA

• Purificação de Vírus:
  • Hospedeiros de E. coli infectados incubados a 37°C até lise (transição turva→clara)
  • Tratado com DNase/RNase para degradar ácidos nucleicos do hospedeiro.
  • Centrifugado para remover detritos celulares
  • Fagos concentrados por precipitação com PEG
  • Purificado utilizando centrifugação em gradiente de CsCl
• Extração de DNA:
  • Capsídeos virais digeridos com Proteinase K/SDS
  • Ácidos nucleicos extraídos através de fenol-clorofórmio
  • DNA precipitado com etanol ressuspendido em tampão TE
  • Pureza/integridade verificada por:
    • Espectrofotometria Nanodrop
    • Eletroforese em gel de agarose (banda característica de ~48,5 kb)

Passo 2: Construção da Biblioteca

• Fragmentação:
  • DNA fragmentado ultrassonicamente em fragmentos de 300-800 pb
  • QC Crítico: Distribuição de fragmentos confirmada através do Bioanalisador Agilent
  • Precaução: Evitar a sobre-fragmentação perto dos locais cos
• Modificação Final e Ligação do Adaptador:
  • Reparação das extremidades dos fragmentos:
    • Amortecimento
    • fosforilação 5'
    • A-pesca
  • Adaptadores Illumina ligados
  • Amplificação PCR de ciclo limitado (≤8 ciclos) para minimizar viés

Passo 3: Sequenciação de Alto Débito

• Seleção de Plataforma:
  • Illumina NovaSeq: Aplicações de cobertura profunda
  • Oxford Nanopore: Validação de variantes estruturais
  • Requisito de Cobertura: Mínimo de 50× de profundidade para uma montagem precisa do site cos/região de repetição.

Passo 4: Análise de Dados

Processamento de Dados Brutos

• A avaliação inicial da qualidade foi realizada utilizando o FastQC, seguida de filtragem com o Trimmomatic para remover:
  • Leituras de baixa qualidade (pontuação Phred <20)
  • Sequências de adaptadores
  • Fragmentos curtos (<50 pb)

Alinhamento e Montagem de Sequências

• Alinhamento baseado em referência:
  • Leituras mapeadas por BWA-MEM ao genoma de referência λ (GenBank: J02459)
  • Gerar arquivos SAM/BAM para análise posterior
• Assemblagem de novo:
  • O SPAdes gerou contigs a partir de dados de leitura única ou de baixa qualidade.
  • Integridade estrutural do site cos verificada

Análise de Variação e Anotação Funcional

• Deteção de variantes:
  • GATK HaplotypeCaller identificou SNPs/indels
  • Incluídas mutações críticas do sítio (por exemplo, locus ATTP)
• Anotação do genoma:
  • Anotação automática de genes Prokka (por exemplo, repressores CI, clusters de genes de cauda)
  • Validação manual de regiões regulatórias (promotores PL/PR)

Visualização e Interpretação

• IGV (Visualizador de Genómica Integrativa) examinado:
  • Perfis de profundidade de cobertura
  • Regiões de recombinação genómica
  • Confirmação de variante estrutural

Considerações Técnicas Chave para o Sucesso

• Pureza da Amostra:
  • A centrifugação em gradiente de CsCl eliminou a contaminação por DNA do hospedeiro.
  • Verificado pela ausência de bandas extranhas na análise eletroforética.
• Controlo de Fragmentação:
  • Os parâmetros de ultrassonicação otimizados preservaram os locais cos (cosL/cosR)
  • Impedida a funcionalidade de embalagem de terminase comprometida.
• Sinergia da Plataforma de Sequenciamento:
  • A Illumina garantiu a precisão da chamada de base.
  • Nanoporosidade variações estruturais resolvidas (por exemplo, estados de integração de profagos)
• Validação de Montagem:
  • Contig N50 >40 kb (possibilitando a reconstrução do genoma completo)
  • Cobertura profunda simétrica flanqueando sites cos

Lambda em Acção: Estudos de Caso

Desenvolvimento de Ferramentas de Biologia Molecular

• Otimização de Engenharia Vetorial:
  • Integridade da sequência de vetor modificada verificada (por exemplo, locus de inserção λGT11)
  • Assegurou a integração precisa de genes estrangeiros (por exemplo, LacZ)
• Análise de Promotores/Operões:
  • Elementos regulatórios mapeados com precisão (por exemplo, promotores PL/PR, operões Cro/Ci)
  • Facilita o design racional de componentes biológicos sintéticos.

2. Estudos de Interação Hospedeiro-Fago

• Mecanismos de Reconhecimento do Hospedeiro:
  • Análise comparativa da capacidade de infecção entre estirpes de E. coli
  • Pontos quentes de mutação localizados na proteína J (determinante de adsorção do hospedeiro):
    Mutacões pontuais
    Eliminações
• Conversão Lisogénica:
  • Status de integração attP anotado dentro do genoma hospedeiro
  • Analisou a dinâmica de regulação da expressão do repressor CI

3. Verificação da Qualidade do NGS

• Validação da Plataforma de Sequenciação:
  • Curvas padrão construídas utilizando o genoma de referência λ
  • Perfis de erro quantificados:
    Taxas de inserção-deleção
    Frequências de substituição de bases
• Otimização do Sistema de Preparação de Bibliotecas:
  • Avaliação da uniformidade de cobertura em regiões extremas de GC (λ genoma GC=50%)
  • Refinamento do protocolo de fragmentação informado

4. Genómica Evolutiva e Comparativa

• Expansão da Família de Genes:
  • Analisou a variação no número de cópias do módulo da proteína da cauda (por exemplo, proteína do filamento gpH)
  • Revelados os fatores de adaptação ao alcance do hospedeiro
• Rastreamento de Rearranjo Genómico:
  • Assinaturas de transferência horizontal de genes detetadas através de:
    Análise de repetições em tandem
    comparações de arquitetura de sites cos

Resumo das Vantagens Técnicas

Estudo de Caso 1: Como a Lambda Expõe a Evolução do seu Anfitrião

1. Descoberta de Localizações de Integração Não Convencionais

• Perspectiva Mecanística:
  • O mapeamento de alta resolução baseado em NGS revelou a integração do fago λ em locais genómicos não canónicos do hospedeiro. Esta descoberta demonstra uma flexibilidade de integração além das restrições tradicionais da recombinação attB-attP.
• Principais Conclusões:
  • Identificados >300 alvos de integração genómica únicos em hospedeiros
  • Excede significativamente o repertório conhecido de locais attB.
  • Estabelece uma plasticidade de local de integração sem precedentes.

2. Consequências Fenotípicas e Adaptação do Hospedeiro

• Impactos Funcionais Validados por Sequenciamento:
  A análise integrada de sequenciação-fenotipagem demonstra que a integração não convencional induz:
  • Alterações na Motilidade: A integração proximal aos genes flagelares perturba as vias regulatórias da motilidade.
  • Resistência Antibiótica Aumentada: Inserção perto de genes de resistência ativa a expressão ou desativa elementos repressivos
• Significado Conceitual:
  Esta evidência redefine a lisogenia de um estado dormente para um motor ativo de:
  • Remodelação genómica do hospedeiro
  • Trajetórias evolutivas adaptativas (Tanouchi Y et al., 2017)

Análise de lisogénios com integração em locais secundários (Tanouchi Y et al., 2017)

Estudo de Caso 2: Engenharia Genética de Precisão Usando as Ferramentas do Lambda

1. Caracterização do Local

• Fundação Mecanicista:
  O sequenciamento inicial do fago λ (incluindo a metodologia de Sanger) pioneiro no mapeamento preciso do locus att:
  • Sequência central de 15 bp identificada (GCTTTTTTATACTAA)
  • Arquitetura de braço de flanqueamento definida (attP com braços P/P'; attB com braços B/B')
  • Locais de ligação da recombinase resolvida (Int, IHF, Xis), incluindo o reconhecimento específico do braço do Int.
• Aplicações de Engenharia:
  Dados de sequência precisos ativados:
  • Modificação de Vetor:
    • inserção do vetor pKO5.2-C.1 de um fragmento contendo attR de ~1,6 kb
    • Clonagem direcional via attR verificado por sequência
  • Engenharia de Baculovírus:
    • Inserção de Dest-Bac attR-EGFP no locus UL41
    • A verificação de sequenciamento impediu a interrupção da função do gene viral.

Desenvolvimento do Sistema de Recombinase

• Resolução Molecular:
  Caracterização do sequenciamento do genoma:
  • gene int (integrase, genoma λ 34.502-35.941 bp)
  • mecanismo de clivagem do gene xis (excisão) através da ligação a repetições invertidas
• Tradução de Tecnologia:
  • Desenvolvimento comercial do Lambda Clonase™ baseado em recombinases sequenciadas
  • Implementado para recombinação attL-attR de alta eficiência.

3. Validação da Fidelidade do Sistema

• Verificação Experimental:
  A PCR e a sequenciação confirmaram a integridade do BAC recombinante:
  • Ligações da sequência flanqueadora do UL41 corretas
  • Fidelidade de inserção do gene (correspondência da banda de 424 bp do DsRED2)
• Significado do Controlo de Qualidade
  • Sequenciação estabelecida como padrão ouro para o sucesso da recombinação (verificação da fusão do local att)
  • Demonstrou recombinação in vitro eficiente sem marcadores de seleção negativa (ccdB) (Schmeisser F et al., 2007)

Diagrama esquemático da estratégia de substituição de alelos utilizando o vetor pKO5 (Schmeisser F et al., 2007)

Estudo de Caso 3: Projetar Vacinas Melhores com Exibição Lambda

Engenharia de Vetores de Precisão

• Caracterização Estrutural: O sequenciamento do genoma mapeou a região codificadora da proteína do capsídeo λ D (gpD) (NC_001416: 20.300-21.200 pb), confirmando o seu N-terminal como o local de fusão ideal.
• Otimização da Probabilidade de Quadro:
  Forneceu uma base computacional para a probabilidade do quadro natural (teórica de 5,6%, Nota Suplementar S1), permitindo:
  • Inserir otimização de orientação
  • Eficiência no design de bibliotecas
• Validação da Capacidade do Vetor: A sequência confirmada do vetor λ acomoda inserções mais longas (média de 55 aa) em comparação com as limitações do fago M13 (<40 aa).

Conclusão: A arquitetura λ permite a exibição de epítopos conformacionais complexos (por exemplo, o domínio β-barrel do FHBP).

2. Mapeamento de Epítopos Guiado por Sequenciamento Profundo

• Localização Precisa:
  A análise de NGS de 5.172 sequências em quadro nativo mapeou o epítopo FHBP para:
  • Região central: S140-K254 (15/23 locais de contacto do anticorpo)
  • Subdomínios críticos:
    › H248-K254: Motivo de ligação essencial (perda de atividade após mutação)
    › S140-G154: Domínio de manutenção conformacional
• Análise do Domínio Funcional:
  • Limite R247-H248: Transição do limiar de afinidade de ligação
  • S140-G154: Papel estrutural indireto (aumento de 23× na KD quando mutado)

3. Verificação da Adaptabilidade Estrutural

• Diferenciação de Desempenho de Vetores:
  A superioridade do λ sobre o M13 deve-se a:
  • flexibilidade de fusão N-terminal do gpD (guiada por sequenciação)
  • M13 pVIII restrições estéricas (apenas inserções curtas)
• Reconstrução de Epítopos Conformacionais:
  λ supera o M13 devido a:
  • Exibição de fragmentos longos (FRC) preservando interações de longo alcance
  • Manutenção crítica da sinergia de domínio (S140-G154 ↔ H248-K254) (Domina M et al., 2016)

Vantagens Comparativas de Vetores

Enriquecimento de fragmentos de fHbp após seleção por afinidade de bibliotecas exibidas em fago e imunoreatividade dos fragmentos antigénicos selecionados com o mAb 12C1 (Domina M et al., 2016)

Estudo de Caso 4: Como a Lambda Ajuda a Descobrir Novos Sistemas Virais

1. Estrutura do Sistema de Recominação

• Benchmarking Estrutural:
  O sequenciamento do fago λ (Mizuuchi & Mizuuchi, 1985) estabeleceu as dimensões canónicas do local att:
  • attB_λ21 pb
  • attP_λ: 140 bp (braço P) + 80 bp (braço P')
    Estes serviram como referências para caracterizar os sítios att não canónicos do fago Φ24B:
  • attB_Φ24B93 pb (4,4× mais longo)
  • attP_Φ24B427 pb (3× mais longo)
    Conclusão Principal: Sequências att prolongadas indicam divergência mecanicista em relação aos sistemas λ.
• Referência do Domínio Recombinase:
  Domínios de ligação de Int derivados de λ guiados pela validação funcional de Φ24B:
  • Experimentos de deleção confirmaram Int_Φ24B; opera de forma independente da IHF
  • Contrasta fortemente com o Int._λrequisito da IHF
  • Desafios dos paradigmas de integração centrados em λ

2. Otimização do Sistema Experimental

• Adaptação de Ensaios In Vitro:
  Transferido o quadro de recombinação λ (Int, IHF, attP, attB) com modificação chave:
  • attB linearizado_Φ24B eficiência de recombinação duplicada do substrato
  • Inovação crítica além dos protocolos λ padrão
• Sistema de Expressão de Proteínas:
  Utilizou o plasmídeo IHF derivado de λ pEE2003 em E. coli BL21 (Sambrook et al., 1989):
  • Alcançou uma purificação de alto rendimento do Int ativo._Φ24B
  • Ensaios de atividade comparativa ativados

3. Divergência Mecanística e Aplicações

• Avanços Evolutivos:
  "padrão ouro" revelou adaptações específicas para Φ24B:
  • Arquitetura ATT Assimétrica:
    B-braço: 49 pb vs. B'-braço: 20 pb
  • Independência da IHF:
    Funcional em mutantes ΔhimA (cepa JW1702)
    recombinação λ estritamente dependente de IHF
• Implicações Biotecnológicas:
  A capacidade de integração promíscua do Φ24B (>300 locais hospedeiros) sugere utilidade como:
  • Nova ferramenta de edição do genoma
  • Superior a λ em versatilidade de site

Validação: Demonstrou uma eficiência de integração 3,8× superior à dos sistemas λ (Mohaisen MR et al., 2020)

Determinação dos locais attP e attB mínimos utilizados pelo IntΦ24B (Mohaisen MR et al., 2020)

Conclusão

O sequenciamento do genoma do fago lambda evoluiu para uma metodologia fundamental na biologia molecular e na engenharia genética. Protocolos de caracterização sistemática, juntamente com estruturas analíticas avançadas, permitem uma delineação abrangente da arquitetura genética do fago λ. Essas capacidades facilitam aplicações críticas em diversos domínios:

• Desenvolvimento de Ferramentas Moleculares: Engenharia de precisão de vetores de clonagem
• Inovação Terapêutica: Plataformas de exibição de fagos e design de vacinas
• Soluções Biomédicas: Desenvolvimento de agentes antimicrobianos direcionados

O contínuo aperfeiçoamento tecnológico irá elevar ainda mais a proposta de valor do sequenciamento λ, proporcionando insights estruturais de alta resolução e expandindo a sua utilidade como um padrão de referência genómica versátil. Esta progressão promete acelerar a descoberta em pesquisas biológicas fundamentais e aplicadas.

Para uma abordagem mais detalhada sobre o sequenciamento de fágios, consulte "Sequenciação do Genoma de Fagos: Métodos, Desafios e Aplicações.

Para mais informações sobre o que é o sequenciamento de fagos, consulte "O que é a Sequenciação de Fagos? Um Guia Completo para Investigadores.

Para mais informações sobre como construir e utilizar uma base de dados de sequências de fago, consulte "Construção e Utilização de Bases de Dados de Sequência do Genoma de Fagos.

Referências:

1. Tanouchi Y, Covert MW. Combinação de Análise Abrangente da Integração do Fago Lambda Fora do Local com um Método Baseado em CRISPR para Caracterizar a Fisiologia a Montante. mBio. 2017 Set 19;8(5):e01038-17.
2. Schmeisser F, Weir JP. Incorporação de um sistema de recombinação de fago lambda e deteção de EGFP para simplificar a mutagénese de cromossomos artificiais bacterianos do vírus do herpes simples. BMC Biotecnologia14 de maio de 2007; 7:22.
3. Domina M, Lanza Cariccio V, Benfatto S, Venza M, Venza I, Borgogni E, Castellino F, Midiri A, Galbo R, Romeo L, Biondo C, Masignani V, Teti G, Felici F, Beninati C. Caracterização funcional de um epítopo de anticorpo monoclonal utilizando uma plataforma de exibição de fago lambda com sequenciação profunda. Relatórios Científicos. 2016 Ago 17;6:31458.
4. Roy S, Peter S, Dröge P. Produção versátil de vetores de DNA sem costura em E. coli utilizando integrase de fago lambda aprimorada. PLoS One2022, 23 de setembro; 17(9): e0270173.
5. Mohaisen MR, McCarthy AJ, Adriaenssens EM, Allison HE. O Sistema de Recominação Específico do Local do Bacteriófago Escherichia coli Φ24B. Front Microbiol. 2020, 9 de outubro; 11:578056.