Sequenciação do Genoma de Fagos: Métodos, Desafios e Aplicações

Sequenciação do genoma de fagos constitui uma metodologia essencial dentro da microbiologia e biotecnologia, permitindo uma exploração detalhada da arquitetura genética dos bacteriófagos. Decifrar esses genomas virais é fundamental para diversas aplicações, que vão desde inovações terapêuticas até o aprimoramento da nossa compreensão das dinâmicas dos ecossistemas microbianos. Este artigo examina as técnicas de sequenciação utilizadas, os desafios de pesquisa associados e as aplicações impulsionadoras que estão a levar este campo para a frente.

Propriedades Genómicas Distintivas e Importância da Pesquisa dos Bacteriófagos

Como as entidades biológicas mais abundantes da Terra, com mais de 1.031 espécies caracterizadas, os bacteriófagos exibem arquiteturas genómicas únicas que os distinguem dos seus homólogos bacterianos:

• Compactação Extrema: A sobreposição genética atinge uma densidade de 20-30%, apresentando elementos genéticos aninhados onde sequências codificadoras residem dentro de outros genes.
• Plasticidade Estrutural: Repetições terminais (por exemplo, locais COS ou DTRs) permitem mecanismos dinâmicos de empacotamento e recombinação do genoma.
• Adaptação ao Estilo de Vida: Os fagos virulentos (líticos) possuem genomas simplificados que não contêm maquinaria de integração, enquanto as variantes temperadas (lisogénicas) transportam genes de integrase, mas normalmente omitem módulos de lise.

Imperativos de Pesquisa: A análise do genoma de fagos fundamenta uma compreensão crítica das interações com o hospedeiro, trajetórias evolutivas e desenvolvimento terapêutico. Fagos lisogénicos mediadores de aproximadamente 80% da transferência horizontal de genes de resistência a antibióticos, enquanto variantes líticas mostram uma promessa excecional como armas de precisão contra patógenos resistentes a medicamentos. Estas características genómicas distintivas permitem diretamente soluções centradas em fagos para crises de resistência antimicrobiana.

O Fluxo de Trabalho de Sequenciação de Fagos: Da Preparação da Amostra à Análise de Dados

À medida que a investigação sobre fagos avança, os fluxos de trabalho de sequenciação otimizados—abrangendo a preparação de amostras, seleção de plataformas e bioinformática—tornaram-se críticos. Esta secção detalha estratégias e tecnologias-chave ao longo do pipeline de sequenciação.

Técnicas Críticas de Preparação de Amostras

O processamento de amostras de alta qualidade garante o sucesso do sequenciamento, particularmente para matrizes complexas. As otimizações essenciais incluem:

Concentração e Purificação

• Amostras líquidas (por exemplo, água): A ultrafiltração concentra os fagos, aumentando a sensibilidade da deteção.
• Matrizes complexas (por exemplo, solo/esgoto): Combine a filtração por fluxo tangencial (TFF) com técnicas emergentes de separação magnética para maximizar a pureza enquanto minimiza a contaminação do hospedeiro.

Extração de Ácidos Nucleicos

• A filtração por membrana de gel de sílica remove sais e inibidores de extratos de DNA/RNA.
• Os estudos com fagos de RNA requerem transcrição reversa imediata para preservar a integridade.

Descontaminação do Hospedeiro

• As amostras clínicas exigem tratamento enzimático (DNase I/RNase A + Proteinase K; 37°C/1h) para degradar ácidos nucleicos e proteínas do hospedeiro.
• A filtração sequencial de 0,45μm→0,22μm remove detritos bacterianos.
• A seleção negativa com esferas magnéticas (esferas revestidas com anticorpos) alcança >95% de remoção de bactérias em amostras de escarro.

Metodologias de Enriquecimento

Extração de Ácidos Nucleicos

Diagrama de fluxo do processo de extração separada (Tang X et al., 2023)

(2) Seleção da Plataforma de Sequenciamento

O alinhamento estratégico da plataforma com os objetivos de pesquisa garante uma qualidade de dados otimizada:

Otimização de Amostra Especial

• Amostras metagenómicas (DNA viral <0,1%): Implementar WGA ou LASL (ligação de adaptadores para ssDNA)
• Fagos lisogénicos: Induzir com 0,5 μg/mL de mitomicina C antes da sequenciação.

(3) Análise Bioinformática Pipeline

Controlo de Qualidade e Descontaminação

• FASTQC: Avalia a qualidade das leituras e o conteúdo de GC.
• Trimmomatic: Remove sequências de adaptadores e bases de baixa qualidade.
• Bowtie2/BWA: Filtra genomas residuais do hospedeiro.

Montagem e Polimento do Genoma

• Leituras curtas: O SPAdes gera montagens preliminares.
• Leituras longas: Canu/Flye resolvem repetições.
• Phageterm: Valida repetições terminais para circularização.

Anotação de Genes

• Estrutural: Prodigal/GeneMark prevê ORFs; tRNAscan-SE deteta genes de tRNA.
• Funcional: pVOGs e InterProScan anotam domínios; KEGG/GO classificam vias.
• RNAs não codificantes: Infernal identifica elementos regulatórios (por exemplo, crRNAs).

Genómica Comparativa

• VIRIDIC/VCONTACT2: Classificar fagos através de redes de similaridade de nucleótidos/proteínas.
• FastTree/RAxML: Reconstruir relações evolutivas.

(4) Visualização e Interpretação de Dados

• Cartografia Genómica:
  • CIRCOS: Ilustra características estruturais e regiões sinécticas.
  • IGV: Visualização multiplataforma de dados de alinhamento.
• Análise Funcional de Redes:
  • Cytoscape: Mapeia interacções genéticas para elucidar módulos funcionais e mecanismos de adaptação do hospedeiro.

Para ver como a plataforma Illumina pode sequenciar em profundidade bibliotecas de fagos, veja "Sequenciação Profunda de Bibliotecas de Fagos Usando Plataformas Illumina.

Desafios Centrais e Avanços Tecnológicos na Investigação de Fagos

Desafio I: Detecção de Fagos Lisogénicos - Os "Assassinos Invisíveis"

Nature do Desafio

Fagos lisogénicos evitam a deteção integrando-se como profagos nos cromossomas do hospedeiro. Os métodos de cultura tradicionais detectam <1% de fagos livres devido a:

• Integração oculta: Profagos permanecem latentes nos genomas hospedeiros.
• Limitações dos biomarcadores: Apenas 60% possuem genes de integrase (int), enquanto os locais attP/attB apresentam alta variabilidade de sequência.
• Riscos ecológicos: Os profagos frequentemente contêm genes de resistência a antibióticos (por exemplo, SUL1 no solo) ou fatores de virulência, acelerando a propagação patogénica através da transferência horizontal de genes.

Soluções Inovadoras

Desafio II: Anotação ORFan - "Matéria Escura Funcional"

Causas Raiz

• Alta fração desconhecida: 40-50% dos genes do crAssphage não têm homólogos; bases de dados tradicionais (pVOGs/InterProScan) alcançam <20% de sensibilidade na anotação.
• Origens complexas: A transferência horizontal de genes, a sobreposição de genes e a domesticação de transposões impulsionam a singularidade das sequências.

Soluções Multidimensionais

Desafio III: Montagem de Sequências Repetitivas - "Quebra-Cabeças Genómicos"

Gargalos Técnicos

• Regiões de alta repetição: Repetições terminais (sites cos) e tandems de cápside (15-50 kb) fragmentam montagens de Illumina (por exemplo, fago Vibrio harveyi: 21 contigs iniciais).
• Erros algorítmicos: Os montadores interpretam erroneamente repetições como regiões heterozigóticas (por exemplo, má montagem do SPAdes).

Abordagens Inovadoras

Desafio IV: Barreiras de Amostras de Solo/Intestino

Fagos do Solo: Adsorção e Baixa Abundância

• Fagos Intestinais: Gargalos de Associação ao Hospedeiro
• Cultivo de hospedeiros: >80% das bactérias intestinais requerem meios personalizados (por exemplo, heme/vitamina K1); <1% de cultivabilidade.
• Fagos sem placas: >60% indetectáveis por ensaio de placas → FACS + sequenciação de células únicas (por exemplo, crAssphage).
• Previsão do anfitrião:
  • PhiML: 50-70% de precisão → melhorado pelo emparelhamento de espaçadores CRISPR
  • Coocorrência metagenómica: Análise simultânea de viroma/bactérias

Cenários de aplicação: da pesquisa básica à transformação industrial

Controlo Biológico

Este estudo isolou um novo bacteriófago de cauda longa vB (família Siphoviridae) que visa especificamente Xanthomonas oryzae (Xoo), o agente causador da mancha bacteriana das folhas do arroz. O fago apresentou uma especificidade rigorosa, lisando apenas Xoo sem afetar espécies bacterianas não relacionadas.

Eficácia Biocontrol Significativa: In vitro, o tratamento com fagos alcançou uma redução de 99,95% nas células viáveis de Xoo em 48 horas. Importante, uma única aplicação em campo da formulação pura de fagos proporcionou uma supressão da doença de 90,23% ao longo de um período de 7 dias. No entanto, a eficácia foi notavelmente diminuída quando o leite desnatado foi incorporado à formulação. Estes resultados demonstram coletivamente o alto potencial do fago vB como agente de biocontrolo para a gestão ambientalmente sustentável da mancha bacteriana das folhas do arroz (Jain L et al., 2023).

Aplicações Clínicas da Terapia com Fagos

Intervenção na Pancreatite Necrosante

Um paciente com infeção por Acinetobacter baumannii multirresistente teve alta com sucesso após 245 dias de hospitalização, após ter recebido o primeiro cocktail de fagos intravenoso aprovado pela FDA para pancreatite necrosante.

2. Penetração demonstrada na barreira hematoencefálica

Num caso de encefalite pós-craniotomia, a administração intravenosa de fagos suprimou com sucesso a proliferação bacteriana no sistema nervoso central, apesar de um curso de tratamento abreviado. Este resultado fornece evidências clínicas da passagem de fagos através da barreira hematoencefálica.

3. Gestão da Coinfecção por COVID-19

Entre quatro pacientes com COVID-19 em estado crítico com infeções concomitantes por A. baumannii resistente a carbapenemas (CRAB), dois conseguiram ter alta e reabilitação através de terapia intravenosa com fagos em uso compassivo (Li Y et al., 2023).

Combate à Resistência Bacteriana

O fago VB/F14 demonstra um potencial significativo no combate à Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenemas (CRKP) através de um mecanismo de ação triplo sinérgico:

• Lise de Hospedeiro Direcionada: O fago apresenta uma atividade precisa contra clones epidémicos de CRKP globalmente prevalentes (ST11, ST14, ST15) e o serótipo capsular KL24. A infeção é altamente produtiva, caracterizada por um curto período latente (20-30 minutos) e um grande tamanho de explosão, libertando uma quantidade substancial de progenie viral por célula infectada (F13: 56 PFU; F14: 87 PFU).
• Disrupção de Biofilme: O VB/F14 combate eficazmente biofilmes através de mecanismos dependentes da concentração. Em concentrações mais elevadas, inibe diretamente a formação de biofilmes. Concentrações mais baixas permitem a sua atividade depolimerase para desmantelar estruturas de biofilme existentes, libertando bactérias embutidas para um estado planctónico vulnerável e aumentando a sua suscetibilidade à penetração de antibióticos.
• Atraso na Resistência: A utilização de um cocktail de fagos duplos (F13 + F14) impede significativamente o surgimento de mutantes CRKP resistentes. Esta combinação retarda o crescimento bacteriano detectável em 7-10 horas em comparação com tratamentos com um único fago, reduzindo substancialmente o risco de resistência surgir através de mutações de ponto único (Senhaji-Kacha A et al., 2024).

Monitorização de Populações Bacterianas

Os bacteriófagos funcionam como sensores e reguladores ambientais críticos dentro dos ecossistemas do solo. Este estudo é pioneiro na aplicação da tecnologia HI-C para capturar in situ as dinâmicas entre fágos e hospedeiros, revelando mecanismos adaptativos chave:

• Mudança de Sobrevivência Induzida por Stress: Sob stress de seca, os fágos exibem uma conversão pronunciada da estratégia de sobrevivência de ciclos líticos para lisogénicos, aumentando as taxas de lisogenia em 70%. Isto envolve a inativação de virões livres e a dormência integrada no hospedeiro, preservando assim a viabilidade populacional.
• Coevolução Orientada pelo Hospedeiro: Os fagos infectam preferencialmente actinobactérias tolerantes à seca. Esta estratégia de "carona" aproveita as adaptações do hospedeiro, aumentando a resiliência dos fagos a estressores ambientais.
• Modulação da Rede Ecológica: A lise mediada por fagos da flora microbiana central (taxa de lise de 45%) desencadeia um desvio viral, libertando nutrientes que reestruturam a composição da comunidade e o potencial funcional.
• Proliferação de Fagos Generalistas: Após a seca, fagos de amplo espectro de hospedeiros (identificados empiricamente em 15 classes bacterianas) demonstram uma vantagem competitiva, aumentando em abundância relativa em 30%. Esta infectividade de amplo espectro facilita uma rápida adaptação ao nicho (Wu R et al., 2023).

Interacções entre fagos do solo e hospedeiros reveladas através de metagenómica Hi-C (Wu R et al., 2023)

Transmissão Mediada de Genes de Resistência a Antibióticos (ARGs)

As práticas agrícolas influenciam significativamente o reservatório e a mobilização de genes de resistência a antibióticos (ARGs) no solo, com a transdução mediada por fágicos a representar um caminho crítico. As principais conclusões revelam:

Os Impactos da Aplicação de Estrume Variam consoante a Fração

• Frações Bacterianas: A fertilização com estrume de vaca cru ou biosólidos aumentou dramaticamente a abundância de ARG bacterianos (por exemplo, strA, SUL1). No entanto, o pré-tratamento de compostagem do estrume mitigou substancialmente este efeito de enriquecimento.
• Frações de Fagos: Em contraste, os níveis de ARG associados a fagos permaneceram inalterados pelo tipo de fertilização, indicando a sua independência em relação a entradas exógenas de curto prazo.

Antibióticos Subclínicos Induzem Transdução Seletiva

• A exposição ao cefoxitina a 1/10 da sua concentração de ponto de interrupção clínica induziu a transdução mediada por bacteriófagos, resultando em um aumento de quatro vezes na resistência de coliformes do solo.
• A ampicilina, a um nível sub-inibitório comparável, não conseguiu induzir a transdução. Este efeito diferencial pode resultar de variações na expressão do gene da β-lactamase necessária para a transdução.

Evidência que Apoia o Mecanismo de Transdução

• A análise quantitativa revelou que a abundância do gene rrnS associado a fagos era oito ordens de magnitude inferior à sua contraparte bacteriana, demonstrando a raridade dos eventos de transdução (aproximadamente 1 em 10⁸ infeções).
• Preparações de fagos purificados confirmaram a ausência de contaminação por DNA bacteriano. Crucialmente, o aumento da resistência ocorreu apenas quando bactérias viáveis coexistiam com fagos, confirmando a dependência da transdução em relação à infecção ativa (Ross J et al., 2015).

Direcções Futuras e Plataformas de Recursos

Tendências Tecnológicas Convergentes

• Sinergia CRISPR-Fago: Utilização de sistemas baseados em CRISPR para editar precisamente genomas de fagos, aumentando a sua especificidade de targeting e potencial terapêutico (por exemplo, demonstrado através da modificação de fagos de Aeromonas).
• Multiómicas de Célula Única: Aplicação de abordagens integradas, como a tecnologia de chip microfluídico, para capturar simultaneamente as respostas transcriptómicas do hospedeiro e monitorizar a dinâmica da infeção por fago em tempo real dentro de células bacterianas individuais.

Plataformas de Recursos Chave para a Investigação de Fagos

PHANOTATE

• Tipo: Ferramenta de Predição de Genes (Baseada em Algoritmos)
• Função Principal: Especializada na anotação de genomas de fágios. Emprega um algoritmo único de teoria dos grafos para identificar caminhos ótimos de quadros de leitura abertos (ORF) em todos os seis quadros de leitura de DNA. O seu princípio subjacente assume que regiões não codificantes prejudicam a sobrevivência dos fágios, penalizando regiões intergénicas e sobreposições de genes.
• Características principais: Aceita sequências de genoma de fago (FASTA); produz sequências de codificação de proteínas previstas (CDS) em múltiplos formatos (GenBank, GFF, GFF3, FASTA, FAA).
• Âmbito: Anotação do genoma específica de fago.

Base de Dados de Actinobactérias / PhagesDB

• Tipo: Base de Dados de Curadoria Especializada
• Função Principal: Repositório centralizado para coletar, curar e disseminar dados sobre fagos que infectam Actinobactérias. Integra dados globais sobre sequências genómicas, hospedeiros de isolamento, morfologias e taxonomia, com contribuições significativas de laboratórios académicos.
• Principais Características: Permite a navegação, pesquisa e download do genoma de fágios (sequências/anotações), análise comparativa e acesso a materiais educativos.
• Âmbito: Exclusivamente Actinobactériophages.

IMG/VR (Genomas Microbianos Integrados e Viromas)

• Tipo: Plataforma Genómica Abrangente
• Função Principal: Plataforma de integração em larga escala (mantida pelo DOE JGI) com o subsistema IMG/VR dedicado ao armazenamento, análise e comparação de genomas virais (incluindo fagos). Agrega sequências de fontes públicas, montagens metagenómicas e projetos do JGI.
• Principais Características: Oferece pesquisa poderosa, genómica comparativa (anotação, classificação funcional, filogenia), ferramentas de visualização e suporta upload/análise de dados do utilizador.
• Âmbito: Todos os vírus, incluindo bacteriófagos.

Conclusão

A genómica de fagos evoluiu de técnicas isoladas para um campo multidisciplinar que integra experimentação em laboratório, bioinformática e inteligência artificial. A queda dos custos de sequenciação de long-read (por exemplo, o PacBio Revio projetado para cerca de 1.000 dólares por genoma até 2025) e o surgimento de ferramentas analíticas dedicadas estão a acelerar a descoberta da "matéria escura" viral. O progresso futuro requer avanços em protocolos de preparação de amostras padronizados, análise integrada de conjuntos de dados cross-omics e validação funcional robusta dos genes de fagos. Alcançar estes marcos é essencial para realizar a aplicação em cadeia completa dos recursos de fagos dentro do quadro integrado de "Uma Saúde".

Para mais informações sobre o que é a sequenciação de fagos, veja "O que é a Sequenciação de Fagos? Um Guia Completo para Investigadores.

Referência:

1. Podlacha M, Węgrzyn G, Węgrzyn A. "Bacteriófagos - Vírus Perigosos a Agir de Forma Incógnita ou Salvadores Subestimados na Luta contra as Bactérias?" Int J Mol Sci. 2024 Fev 9;25(4):2107. doi: 10.3390/ijms25042107
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7. Ross J, Topp E. "Abundância de Genes de Resistência a Antibióticos em Bacteriófagos após Fertilização do Solo com Estrume de Laticínios ou Biosólidos Municipais, e Evidências de Potencial Transdução." Appl Environ Microbiol. Nov 2015;81(22):7905-13. doi: 10.1128/AEM.02363-15