Visão Geral do Sequenciamento de DNA

Tecnologia de sequenciação genómicatambém referido como Tecnologia de sequenciação de DNA, implica a aquisição da disposição de nucleotídeos de um segmento de DNA alvo. No âmbito da investigação científica, obter a sequência de um fragmento de DNA alvo serve como o passo fundamental para investigações subsequentes em biologia molecular e modificações genéticas. À medida que o panorama da genómica, particularmente impulsionado por avanços como Estudos de Associação Genómica em Larga Escala (GWAS)À medida que a medicina continua a amadurecer, a antecipação do risco de doenças e o diagnóstico precoce através de abordagens genómicas emergiu como uma trajetória fundamental na medicina clínica. Além disso, a medicina de precisão, aclamada como uma via chave no futuro da medicina clínica, sublinha a importância inegável da tecnologia de sequenciação genómica dentro do seu paradigma. Cada evolução na tecnologia de sequenciação representa um impulso monumental para diversos campos, incluindo a investigação genómica, a terapêutica de doenças e o desenvolvimento farmacêutico. Esses avanços transformadores contribuem continuamente para a aceleração e enriquecimento da nossa compreensão e capacidades em genómica, moldando, em última análise, o panorama da investigação e prática médica.

Desenvolvimento da Tecnologia de Sequenciação

A evolução da tecnologia de sequenciação de DNA tem sido notável desde a sua criação com o método de Sanger de primeira geração. Com base em princípios diferentes, o progresso da tecnologia de sequenciação pode ser segmentado em três etapas: primeira geração. Sequenciação de Sangersegunda geração sequenciação de alto rendimentoe terceira geração molécula única/sequenciação por nanoporo. Cada geração tem os seus próprios pontos fortes e fracos; por isso, as suas aplicações variam em conformidade. Atualmente, o mercado de sequenciação é dominado por Sequenciação de Nova Geração (NGS), mas também acomoda a coexistência de sequenciação de Long-read. Sequenciação de leitura longa tecnologias.

Sequenciação de Sanger

as tecnologias de sequenciação de primeira geração incluíam o método de terminação de cadeia de nucleótidos duplos de Sanger e o método de degradação química inovado por Alan Maxam e Walter Gilbert. Esta tecnologia inovadora facilitou a sequenciação automatizada de moléculas de ácidos nucleicos. A partir de 1977, a sequenciação de primeira geração conseguia atingir um comprimento de sequenciação de 1.000 pares de bases (pb) com uma taxa de precisão elevada de 99,99%, proporcionando uma ferramenta avançada para a investigação em biologia molecular. Durante um período considerável, este método foi altamente estimado pela sua capacidade de leituras longas, alta sensibilidade e precisão, desempenhando um papel crucial no início do Projeto Genoma Humano. No entanto, Sequenciação de Sanger tem as suas limitações; embora a técnica forneça leituras mais longas em comparação com a sequenciação de segunda geração subsequente, cada corrida de sequenciação pode apenas produzir uma sequência de cerca de 700-1000 pares de bases de comprimento, uma vez que o comprimento de cada leitura é o limite da sua capacidade de sequenciação em corrida única. Dado que um design de primer separado é necessário para cada sequenciação, quando confrontados com a ampla demanda por sequenciação em escala genómica na investigação moderna e em aplicações clínicas, o rendimento relativamente mais baixo, o processo moroso e os custos mais elevados da sequenciação de Sanger limitaram as suas perspetivas para aplicações em grande escala.

Gradualmente, a dominância da sequenciação de primeira geração foi substituída pela emergente sequenciação de segunda geração (Sequenciação de Nova Geração ou NGS). No entanto, a tecnologia de sequenciação de primeira geração ainda possui certas vantagens, como alta precisão, leituras mais longas e a eliminação da necessidade de montagem de sequências. Portanto, mantém-se significativa em alguns campos de pesquisa. Por exemplo, desempenha um papel fundamental em áreas como sequenciação de plasmídeos, validação de locais de mutação, sequenciação de genomas bacterianos pequenos, sequenciação de extremidades de cromossomas artificiais bacterianos e sequenciação de sequências repetitivas.

Figura 1 Princípio da sequenciação de Sanger (Michel G Gauthier 2007)

Sequenciação de Nova Geração

Sequenciação de Alto Débito (HTS), também conhecida como Sequenciação de Nova Geração A sequenciação de nova geração (NGS), ou sequenciação de segunda geração, incorpora principalmente a técnica 454 da Roche, a técnica HiSeq da Illumina, a técnica SoLiD da ABI e a técnica Ion Torrent da Thermo Fisher. Tanto as técnicas 454 como SoLiD foram descontinuadas devido à sua complexidade, alto custo e estabilidade de sequenciação inconsistente. As tecnologias NGS amplamente utilizadas no mercado atual derivam principalmente da Illumina e da Thermo Fisher; empresas como a BGI também estão a promover produtos NGS.

Em 2008, a Applied Biosystems (ABI) e a Invitrogen fundiram-se para criar a Life Technologies, que posteriormente lançou os sequenciadores Ion Torrent e Ion Proton em 2010 e 2012, respetivamente. Em 2014, a Life Technologies foi adquirida pela Thermo Fisher Scientific por uma quantia substancial de 13,6 mil milhões de dólares. Como resultado desta transação, a Thermo Fisher fabricou em massa e promoveu vigorosamente os produtos principais da Life Technologies, especificamente os seus sequenciadores de grau clínico.

Entretanto, em 2014, a Life Technologies foi adquirida pela Thermo Fisher Corporation por uma quantia substancial de 13,6 mil milhões de dólares. Esta aquisição significativa transformou a função dos principais produtos da Life Technologies. Originalmente utilizados para fins de investigação, esses dispositivos de sequenciação foram transformados em sequenciadores de grau clínico, produzidos em massa e integrados de forma harmoniosa no repertório da Thermo Fisher. A decisão da Thermo Fisher de promover esses produtos foi um testemunho do seu potencial em transformar o panorama da genómica clínica.

O advento da tecnologia de sequenciação 454 ajudou a mitigar as limitações inerentes às abordagens de sequenciação de primeira geração. Apresenta características distintivas, como alta capacidade de processamento (com uma produção média que atinge até 0,5G), eficiência de custos e processos que economizam tempo. No entanto, ao sequenciar sequências ricas em estruturas nucleotídicas repetitivas ou sequências, o Sequenciação de Sanger a metodologia revela-se mais apropriada.

A tecnologia de sequenciação Solexa ganhou destaque durante um período caracterizado por rápidos avanços no campo dos chips genéticos e desde então encontrou amplas aplicações na sequenciação de animais, plantas e micróbios. Semelhante à tecnologia de sequenciação 454, a Solexa opera com o princípio de "sequenciação por síntese", apresentando vantagens como a eliminação da necessidade de síntese de sondas e de um entendimento da sequência do genoma do organismo modelo, simplificando assim os procedimentos.

Além disso, esta tecnologia utiliza chips integrados durante a fase de preparação para conectar moléculas de DNA com primers específicos, facilitando a sua ligação específica ao chip. Isso resulta em DNA "monoclonal" e confere características como alta capacidade de processamento (com uma produção média que atinge até 30G), um elevado nível de sensibilidade e uma precisão aprimorada na técnica.

O método de sequenciação SOLiD (Deteção por Ligação de Oligonucleotídeos Suportados) representa uma abordagem tecnológica divergente em contraste com as estratégias mencionadas anteriormente. O seu princípio subjacente gira em torno da ligação em vez da amplificação por PCR. A sequência de DNA alvo é obtida através de múltiplas rondas de sequenciação após a ligação do DNA alvo a sondas fluorescentes de octa-base. Ao eliminar a etapa de "síntese", este método minimiza efetivamente os fenómenos de incompatibilidade durante o emparelhamento de bases, estabelecendo assim uma base para uma maior precisão.

Em comparação com Sequenciação de Sanger, Sequenciação de Nova Geração A Sequenciação de Nova Geração (NGS) ultrapassou significativamente em termos de capacidade, superando o modus operandi da geração anterior que restringia a sequenciação a apenas uma peça de DNA de cada vez. Uma única execução de NGS pode revelar simultaneamente centenas de milhares a milhões de sequências de nucleótidos, diminuindo assim dramaticamente o tempo necessário para a sequenciação em escala genómica. Além disso, a aplicação generalizada da tecnologia NGS deve-se em grande parte ao seu custo reduzido.

Sequenciação de leitura longa

O Sequenciação de leitura longa técnicas, conhecidas como a tecnologia de Tempo Real de Molécula Única (SMRT) da PacBio e a tecnologia de Nanopore da Oxford Nanopore Technologies, abordam deficiências associadas a Sequenciação de Nova Geração (NGS). Apesar da revolução na capacidade de processamento oferecida pelo NGS, as suas limitações inerentes em relação ao comprimento curto das leituras criam obstáculos durante o sequenciamento e a montagem de regiões de sequência altamente repetitivas. Além disso, obter informações precisas sobre a sequência de genes a partir do NGS requer não apenas uma alta cobertura de sequenciamento, mas também técnicas de montagem de sequência precisas.

Sequenciação de leitura longa as tecnologias oferecem uma solução para estas limitações, fornecendo resultados de sequenciação para sequências longas individuais de novo. Estas tecnologias, também conhecidas como sequenciação de moléculas únicas técnicas, conseguem realizar este feito ao executar sequenciação em sequências longas únicas, contornando a necessidade de amplificação por PCR da molécula alvo. O resultado é que estes métodos fornecem diretamente informações de sequência de ácidos nucleicos que abrangem dezenas de milhares de pares de bases, garantindo uma alta capacidade de processamento.

Em outubro de 2015, a Pacific BioSciences (PacBio) apresentou o sistema Sequel, um sequenciador de terceira geração desenvolvido em torno da sua tecnologia de Tempo Real de Molécula Única (SMRT). O Sequel é caracterizado por um chip metálico dotado de numerosos guias de onda em modo zero (ZMWs) — na verdade, aberturas circulares com um diâmetro de apenas 100nm — contendo polimerase de DNA, a amostra de DNA a ser sequenciada e trifosfatos de desoxirribonucleotídeos (dNTPs) marcados fluorescentemente. Os canais ZMWs concentram a luz relevante intensamente numa minúscula zona de deteção na parte inferior, que é então capaz de registar a fluorescência distinta de cada tipo de dNTP, determinando assim a sequência de bases do ácido nucleico.

A eficácia da tecnologia SMRT depende de três componentes-chave: 1) a DNA polimerase, onde o comprimento da leitura sequenciada depende principalmente da atividade enzimática da polimerase. Como esta é suscetível a danos causados pelo laser utilizado na deteção, é uma consideração importante. 2) A rotulagem dos dNTPs com entidades fluorescentes na extremidade 3' do fosfato. À medida que a síntese de DNA avança, a quebra da ligação fosfodiéster 3' liberta as entidades marcadas utilizadas para a deteção, minimizando assim a hindrance estérica e favorecendo uma síntese de DNA ininterrupta. Isso garante a extensão do comprimento da leitura. 3) A função distintiva das aberturas do ZMW, que se mostram úteis na discriminação dos sinais de reação dentro do ruído da forte fluorescência circundante. A sua resistência estrutural é enfatizada pela faixa de energia limitada devido à luz do laser que não consegue penetrar nos pequenos orifícios para alcançar a área superior da solução. Isso garante que os sinais fluorescentes se originem exclusivamente da pequena zona de reação, deixando os monómeros fora do poro na escuridão—minimizando efetivamente a fluorescência de fundo.

Tecnologia de sequenciação por nanoporo (Fonte da imagem: Nanopore)

Simultaneamente, a Oxford Nanopore Technologies lançou o seu sequenciador de terceira geração, o MinION, baseado na tecnologia de Nanopore. Os modelos operacionais incluem uma bicamada lipídica especial com eletrodos de um lado, posicionada sobre um nanopore. Esta bicamada contém vários nanopores compostos por proteínas alfa-hemolisina, cada uma acomodando uma exonuclease de ácido nucleico. O molde de DNA que se move para dentro do nanopore liga-se à exonuclease, que coordena para cortar sucessivamente as bases de DNA que transitam através do nanopore. Quando cada base passa, gera um bloqueio de corrente único. Coletivamente, a deteção e interpretação destas minúsculas variações de corrente permitem a determinação do tipo de base relacionado, resultando na elucidação da sequência de toda a molécula de DNA.

Tabela 1 Comparação das vantagens e desvantagens do sequenciamento de próxima geração e do sequenciamento de long-read

Nos últimos anos, tem-se assistido a uma forte adoção de Sequenciação de leitura longa tecnologias em análises genómicas. Estas metodologias têm impulsionado significativamente o progresso da exploração e decifração genómica, realizando avanços substanciais. A sequenciação de longas leituras, sequenciação direta de moléculas de DNA individuais, proporciona maiores comprimentos de leitura e permite uma alta sensibilidade, montagem sem molde e sequenciação direta de metilomas de DNA e RNA. No entanto, existem limitações. São necessários controles operacionais precisos, os custos são substanciais, o software de processamento bioinformático maduro é escasso e as taxas de erro são elevadas. Especialmente em contextos que exigem custos e precisão, como a medicina de precisão e a triagem precoce do câncer, a aplicação prática destas tecnologias continua a ser limitada.

Pelo contrário, enquanto Sequenciação de Nova Geração (NGS) tem desvantagens, incluindo a dependência de modelos existentes, comprimentos de leitura curtos e viés de sequência, mas o seu sistema maduro, capacidade de alto rendimento, alta sensibilidade, alta resolução e baixo custo tornam-no mais acessível e amplamente adotado em vários laboratórios. De facto, a relação entre Sequenciação de leitura longa e o NGS não é caracterizado por competição ou substituição, mas sim, estas tecnologias atuam como ativos complementares.

Tomando como exemplo a sequenciação de grupos de resistência microbiana, a maioria dos genes de resistência está localizada em plasmídeos, muitos dos quais não são sequenciados com sucesso em pesquisas preliminares. A dependência exclusiva da NGS não consegue obter com precisão as sequências de plasmídeos que contêm genes de resistência. Neste ponto, a sequenciação de Long-read pode ser utilizada para sequenciar diretamente o DNA de molécula única do plasmídeo. No entanto, devido à baixa precisão e exatidão da sequenciação de Long-read, após obter a sequência do plasmídeo, é frequentemente necessário usar NGS para gerar um grande número de leituras curtas de alta precisão para comparação, levando a uma sequência de plasmídeo mais precisa.

À medida que o custo da sequenciação de Long-read continua a diminuir, mais cenários irão exigir a combinação de tecnologias de NGS e sequenciação de Long-read para obter sequências desconhecidas precisas em futuras aplicações clínicas. Estas duas tecnologias podem complementar-se, melhorando mutuamente os seus respetivos valores de aplicação.

Princípios e Processos da Tecnologia NGS

Em 2005, o sistema Genome Sequencer 20 (GS 20) foi introduzido pela empresa 454, pioneiro na era da "Sequenciação por síntese" (SBS). Hoje, a metodologia SBS é fundamental para as plataformas de sequenciação de próxima geração (NGS) da Thermo Fisher Ion Torrent e Illumina.

A essência da tecnologia SBS é comum entre plataformas e consiste principalmente em três etapas principais: 1) Preparação da biblioteca, que envolve a fragmentação de amostras de DNA de cadeia longa em segmentos curtos para criar uma biblioteca de DNA. Durante a fragmentação, adaptadores são anexados a ambas as extremidades dos segmentos curtos para facilitar a fixação subsequente dos fragmentos, utilizando os adaptadores como locais de ligação para primers nos processos de amplificação; 2) Carregamento, no qual a biblioteca de DNA é alocada em um meio de sequenciação e passa por amplificação. O objetivo desta etapa é multiplicar o número desses segmentos curtos, gerando uma quantidade suficiente de fragmentos curtos idênticos para amplificar os sinais na fase de sequenciação subsequente. Isso permite a detecção de informações de sequência; 3) Sequenciação, onde o DNA de dupla fita amplificado passa por desnaturação para formar DNA de fita simples, que então serve como molde. A integração de nucleotídeos únicos durante cada rodada de síntese é monitorada e as informações de sequência são discernidas a partir do registo de sinais (por exemplo, fluorescência, alterações de pH).

As diferenças entre os produtos de NGS da SBS oferecidos por diferentes empresas surgem em aspectos como processamento de amostras, deteção de sinais e fixação de fragmentos.

Os procedimentos padrão para Sequenciação de Nova Geração as tecnologias incluem o seguinte:

Para a tecnologia de sequenciação 1.3.1454, o processo começa com a fragmentação da amostra, seguida pela seleção de fragmentos entre 500 e 800 pares de bases (pb) de comprimento. Em seguida, são adicionados adaptadores a ambas as extremidades desses fragmentos. Os fragmentos de DNA ligados a adaptadores são combinados com esferas magnéticas, encapsuladas em um sistema de água em óleo, e associados a uma placa de reação. O sistema é então incorporado a uma placa PTP onde os quatro tipos de bases são adicionados sequencialmente para sequenciação. Por fim, os sinais são monitorizados e os dados de sequenciação são coletados.

A tecnologia de sequenciação Solexa começa de forma semelhante com a fragmentação da amostra. Subsequentemente, é estabelecida uma biblioteca e amplificada num chip embutido com primers para produzir clones únicos. O sistema introduz então quatro dNTPs rotulados de forma diferente juntamente com uma DNA polimerase modificada. Os sinais fluorescentes coletados são registados para extrair dados de sequência.

A tecnologia de sequenciação Solid começa por fragmentar a amostra e anexar adaptadores a ambas as extremidades desses fragmentos. Segue-se a amplificação por PCR e o enriquecimento com micropartículas. Esferas magnéticas são então adicionadas, permitindo a hibridização entre os adaptadores e sequências específicas de adaptadores no molde. Quatro sondas de dupla base com corantes fluorescentes diferentes são ligadas à amostra. O passo final envolve a deteção de sinais fluorescentes e a recolha de dados de sequência.

Baseando-se nas descrições acima, colocámos em contraste as características de três tecnologias de sequenciação de segunda geração ao lado de Sequenciação de Sanger tecnologia (tabela 1). Também foi realizada uma comparação horizontal das tecnologias de sequenciação de segunda geração (tabela 2). Pode-se inferir que, em comparação com a sequenciação de Sanger de primeira geração, todas as tecnologias de sequenciação de segunda geração demonstram alta capacidade de produção, alta precisão e eficiência de custos.

Tabela 2: Comparação de Tecnologias de Sequenciação

Tabela 3: Comparação de Três Tecnologias de Sequenciação de Próxima Geração

Controlo de Qualidade de Dados para NGS

O processo de sequenciação na Synthesis-by-Sequencing (SBS) envolve um problema notável: à medida que a cadeia sintetizada se alonga, a eficiência da DNA polimerase diminui, reduzindo simultaneamente a sua especificidade. Isso resulta em um aumento gradual na taxa de erro de síntese de bases à medida que a sequenciação avança, acentuando a importância do controlo de qualidade (CQ) em Sequenciação de Nova Geração dados (NGS) para análises subsequentes. Isto também se torna um identificador crucial ao avaliar a consistência e a qualidade dos instrumentos de sequenciação.

Dentro do quadro de QC para saídas de NGS, os parâmetros de importância primordial incluem:

1) Q20, Q30 e Q40: Na sequenciação de genes de alto rendimento, cada base é atribuída a um valor de qualidade (Q), quanto maior o valor de Q, menores são as chances de uma medição errónea da base, calculado pela fórmula Q = -10logP. Q20 e Q30 representam a proporção de bases com valores de qualidade iguais ou superiores a 20 ou 30, respetivamente.

2) Profundidade de sequenciação: Refere-se à razão entre o número total de bases obtidas a partir da sequenciação e o tamanho do genoma alvo. Se o tamanho do gene é 2M e a profundidade de sequenciação é 10X, a quantidade total de dados obtidos é de 20M. Assim, a profundidade de sequenciação é calculada como Dados Totais (20M) / Tamanho do Genoma (2M) = 10X.

3) Cobertura de sequenciamento: Define a proporção de sequências obtidas a partir do sequenciamento em relação ao genoma completo. Dada a presença de estruturas complexas, como secções com alto conteúdo de GC e sequências repetidas no genoma, as sequências montadas após o sequenciamento podem não cobrir todas as áreas. As regiões desprovidas de sequências são denominadas "Lacunas". Por exemplo, se a cobertura de sequenciamento de um genoma bacteriano é de 98%, 2% da região de sequência permanece não sequenciada.

Tecnologias Derivadas para NGS

Embora Sequenciação de Próxima Geração O NGS, por si só, apenas produz sequências de DNA, mas pode gerar uma variedade de informações, incluindo transcriptomas direcionados, metilomas e metagenomas quando combinado com várias técnicas de processamento de amostras (como reversão de transcrição in vitro, captura de sequências e tratamento com bisulfito). A correlação dessas técnicas é ainda facilitada por análises bioinformáticas subsequentes. Com a precisão de alto rendimento oferecida pelo NGS, uma vasta gama de perspetivas clínicas é previsível. Apresenta aplicações potenciais em diversos cenários clínicos, como rastreio de câncer, testes genéticos, medicina de precisão e melhoramento de culturas, ampliando assim significativamente a extensão da sua utilidade (ver Tabela 4).

Tabela 4. Tecnologias derivadas de sequenciação NGS e suas aplicações clínicas

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