Construção de Bibliotecas para Sequenciação de Nova Geração (NGS)

Sequenciação de nova geração (NGS), também reconhecido como sequenciação de alto rendimento, evoluiu a partir das tecnologias de PCR e microarrays de genes. Este método de sequenciação inovador introduz terminações de terminação reversível, permitindo que a sequenciação ocorra simultaneamente com a síntese. A determinação das sequências de DNA é realizada ao capturar as bases recém-adicionadas com marcadores específicos durante o processo de replicação do DNA. Numa importante inovação, a Roche introduziu o primeiro sequenciador de próxima geração, o Roche 454, em 2005, marcando o início da era da sequenciação de alto rendimento. E a Illumina está a tornar-se a plataforma de sequenciação mais popular.

Esta tecnologia de sequenciação tem uma importância primordial na ciência da vida e na pesquisa farmacêutica devido à sua capacidade de gerar rapidamente dados substanciais com um comprimento de leitura relativamente curto. No fluxo de trabalho de NGS, o primeiro passo envolve a construção do DNA da amostra, seguido de testes em máquina e análise subsequente. A construção da biblioteca de sequenciação é uma etapa crucial que dita o sucesso de NGS A qualidade do DNA e dos produtos de construção da biblioteca influencia significativamente parâmetros como a taxa de conversão da biblioteca, a profundidade de sequenciação, a complexidade e a homogeneidade. Portanto, medidas rigorosas de controlo de qualidade são imperativas ao longo de todo o processo de sequenciação.

O que é a Construção de Bibliotecas em NGS?

Uma biblioteca de ADN abrange uma série de etapas preparatórias para amostras de ADN/ARN antes da sequenciação. As amostras originais de ácidos nucleicos não podem ser utilizadas diretamente para sequenciação; apenas amostras processadas podem atender aos requisitos da plataforma de sequenciação. Estas preparações envolvem tarefas como a introdução de extremidades essenciais nas amostras de ADN, um pré-requisito para a sequenciação. Em casos de volume de amostra insuficiente, a amplificação por PCR é empregue para cumprir os critérios da máquina. A construção da biblioteca de ADN forma a base de sequenciação de próxima geração tecnologia de bibliotecas.

Controlo de Qualidade no Fluxo de Trabalho de Preparação de Bibliotecas de NGS pode ser um artigo útil para o sequenciamento e análise.

Representa os passos envolvidos na Sequenciação de Nova Geração: A preparação e amplificação da biblioteca, a sequenciação e a análise de dados são os três passos importantes envolvidos na NGS. (Selvakumar et al., 2022)

A construção de bibliotecas de ADN está no cerne de sequenciação de nova geração tecnologia de bibliotecas. Envolve a etapa crucial de adicionar juntas finais aos fragmentos em exame. Existem vários métodos para a construção de bibliotecas de DNA, categorizados com base nas suas abordagens para a formação de juntas:

• Construção de junção de clonagem TA
• Método Swift
• Construção de biblioteca de transposase
• Construção de amplicões de PCR
• Construção de biblioteca de junção de extremidade plana

Métodos de Preparação de Bibliotecas de NGS

Construção de Biblioteca de Juncão TA Cloning

A construção da biblioteca de junção de clonagem TA é atualmente o método mais prevalente para a construção de bibliotecas. O processo envolve os seguintes passos:

• Fragmentação do DNA genómico.
• Reparação das extremidades do DNA fragmentado e adição de uma cauda A.
• Anexo do adaptador.
• Amplificação da concentração da amostra através da amplificação por PCR.

Esta técnica necessita da síntese prévia de fragmentos-alvo com adaptadores de cauda T e extremidades de cauda A, ligando-os posteriormente a amostras fragmentadas através de clonagem TA facilitada pela DNA ligase.

Método Swift

O método de construção da biblioteca de clonagem TA partilha semelhanças com o método de construção da biblioteca Swift. Envolve a introdução de sequências de junção P5 e P7 em ambas as extremidades do fragmento em análise. Após a reparação das extremidades, a junção P7 é inicialmente ligada na extremidade 3', seguida pela ligação da junção P5 na extremidade 5'. Subsequentemente, a concentração da amostra é aumentada através da amplificação por PCR.

Construção de Biblioteca de Transposase

A pedra angular da construção de bibliotecas de transposase reside no transposão Tn5, essencialmente um fragmento de ADN que codifica o gene da transposase. A construção tradicional de bibliotecas envolve fragmentação de ADN, reparação das extremidades, amplificação da biblioteca e purificação em múltiplas etapas. No entanto, a utilização do Tn5 para a construção de bibliotecas simplifica o processo, condensando várias etapas numa única reação.

O in vitro Os elementos transponíveis do transposão Tn5 utilizados para a construção de bibliotecas incluem a sequência terminal do transposão, o DNA alvo, a transposase (Tnp) e Mg2+ (ativador).

Construção de Biblioteca de Amplicões de PCR

O método de construção da biblioteca de amplicons utiliza uma reação de PCR para introduzir junções nas extremidades dos fragmentos-alvo, necessitando apenas de duas rondas de PCR e purificação para obter a biblioteca desejada. Inicialmente, os primers que contêm a sequência universal são emparelhados com a região-alvo. Subsequentemente, as junções de sequenciação são ligadas através de uma reação de PCR na segunda etapa.

Construção de Biblioteca de Juncção de Extremidade Plana

O método de adaptadores ligadas com extremidades planas envolve a ligação de adaptadores específicos às extremidades de fragmentos de ADN fragmentados. Esta abordagem segue uma série de etapas, incluindo a fragmentação da amostra de ADN, reparação das extremidades, ligação dos adaptadores, recuperação seletiva dos fragmentos de ADN, enriquecimento da biblioteca por PCR e purificação do produto da PCR. O processo de sequenciação para a construção de bibliotecas com adaptadores ligadas com extremidades planas envolve diminuições transitórias no pH dentro do microambiente, que são detetadas e registadas por um eletrodo de pH para facilitar a leitura dos dados.

Construção de Biblioteca de DNA Illumina

Por favor, leia o nosso artigo: Sequenciação de Nova Geração (NGS) da Illumina: Princípios e Fluxo de Trabalho para mais informações.

Fragmentação

A fase inicial da construção da biblioteca envolve abordar as limitações de comprimento de leitura das máquinas de sequenciação. O DNA extraído não pode ser sequenciado diretamente devido a essas limitações. Portanto, são empregues vários métodos, como fragmentação ultrassónica e digestão enzimática, para cortar o DNA em fragmentos de comprimentos adequados. Embora os métodos mecânicos possam incorrer em maior perda de amostra e complexidade, os métodos enzimáticos, particularmente aqueles que utilizam a transposase Tn5, são preferidos pela sua relação custo-eficácia e simplicidade. O transposão Tn5, originalmente identificado em E. coli, é composto por componentes chave, incluindo sequências IS50, sequências de Extremidade Externa (OE), sequências de Extremidade Interna (IE) e genes de resistência a fármacos.

Reparação/Adição da Cauda A

Após a fragmentação, as extremidades do DNA podem apresentar características planas ou irregulares. Nesta etapa, as extremidades dos fragmentos de DNA são modificadas e uma base A distintiva é adicionada para criar uma extremidade adesiva para a posterior ligação do primer de junção.

Fragmentos de ADN gerados no passo anterior, com extremidades pegajosas 5'/3' ou extremidades planas, passam por reparação das extremidades para converter todas as extremidades pegajosas em extremidades planas. Para a junção TA, a fosforilação na extremidade 5' e a adição de um "A" na extremidade 3' são essenciais para o emparelhamento complementar com junções que possuem extremidades pegajosas "T". Este processo envolve a ação colaborativa da polimerase de ADN T4, da quinase de polinucleotídeos T4 e da polimerase de ADN Taq.

Preparação de biblioteca de DNA utilizando um método baseado em transposase (Nextera) desenvolvido pela Illumina. (Head et al., 2014)

• A polimerase de DNA T4 exibe atividade de polimerase de DNA 5'→3', sintetizando DNA na direção 5'→3' e nivelando extremidades protrusas 5'. Além disso, a sua atividade exonuclease 3'→5' nivela extremidades protrusas 3', transformando fragmentos de DNA com extremidades adesivas em DNA com extremidades planas.
• A T4 Polinucleotídeo Quinase é essencial para catalisar a transferência do grupo γ-fosfato do ATP para o extremo hidroxilo da extremidade 5' da cadeia de oligonucleotídeos, preparando as junções para o passo de união subsequente.
• A Taq DNA Polimerase exibe atividade polimerase 5'→3' para sintetizar DNA na direção 5'→3' e atividade desoxirribonucleotidiltransferase para adicionar um nucleotídeo "A" à extremidade 3' do produto de PCR. Estes processos intrincados garantem a preparação de fragmentos de DNA com extremidades otimizadas para as fases subsequentes da construção da biblioteca de DNA Illumina.

Interseções

Fragmentos de ADN com caudas de A adicionadas exibem terminais A proeminentes, facilitando o seu emparelhamento complementar com junções que possuem terminais T. O objetivo principal de incorporar junções é adicionar etiquetas de biblioteca e sequências de oligonucleotídeos que complementem a plataforma de sequenciação às extremidades do ADN fragmentado.

As junções desempenham um papel fundamental na biblioteca, com junções do tipo Y da plataforma Illumina a serem amplamente utilizadas na sequenciação. Estas junções abrangem sequências P5/P7, Index e Rd1/Rd2 SP. As sequências P5/P7 emparelham-se com as sequências no chip de sequenciação, ancorando os fragmentos para teste na Flowcell para completar a amplificação em ponte. O Index distingue entre diferentes amostras na biblioteca mista de sequenciação a bordo, e Rd1/Rd2 SP serve como a região de ligação do primer para a sequenciação Read1 e Read2. A ligadura de junções envolve tipicamente T4 DNA Ligase, reparando cortes de fita simples em DNA de fita dupla e reconectando nucleotídeos adjacentes. Na ligadura de junções, junções com extremidades adesivas "T" e extremidades adesivas "A" podem ser combinadas sem costura, formando uma fita dupla completa.

Amplificação por PCR

Devido à junção adicionada anteriormente, a amplificação direta é alcançada utilizando primers complementares à junção. As extremidades não complementares das junções "Y" adicionadas anteriormente exigem um passo intermédio antes da sequenciação direta. Para sequenciar múltiplas amostras simultaneamente, podem ser adicionados índices/códigos de barras para diferenciar entre as diferentes amostras. Este passo não só ajuda a distinguir várias bibliotecas durante a análise subsequente das amostras, mas também introduz sequências de oligonucleotídeos complementares ao sequenciador em ambas as extremidades através de PCR, especificamente P5/P7.

4 Marcos na Tecnologia de Sequenciação de DNA

Primeiro Avanço: Leitura Direta

• Leitura Pré-Direta: O método de sequenciação original que precedeu a leitura direta envolvia técnicas como clonagem molecular, PAGE e autoradiografia radiográfica.
• Método SBC: Uma reação de degradação química que utiliza reagentes específicos para degradar diretamente moléculas de DNA. Gilbert recebeu o Prémio Nobel de Química em 1980 por inventar o método SBC.
• Método SBS: Baseado na reação de síntese enzimática e na síntese de DNA, também conhecido como o Método de Sanger ou método de terminação terminal de ácido desoxirribonucleico duplo. Este método oferece vantagens como reagentes não tóxicos, facilidade de operação, resultados estáveis, alta precisão e excelente reprodutibilidade.

Segundo Avanço: Automação

• Pioneiros da Sequenciação Automatizada: Akiyoshi Wada, Wilhelm Ansorge.
• A grande inovação na automatização do método SBS surgiu com a invenção do sequenciador SBS automatizado de quatro cores com fluorescência por Leroy Hood. Esta inovação desempenhou um papel crucial no apoio e lançamento do Projeto Genoma Humano (PGH).

Terceiro Avanço: Aumento de Escala

• A emergência e o aprimoramento da tecnologia de sequenciação por eletroforese capilar facilitaram a ampliação.
• Em 1998, a ABI introduziu o sequenciador capilar ABIPrism 3700 (ABI3700), permitindo a escalabilidade direta da tecnologia de sequenciamento. A introdução subsequente da série de sequenciadores MegaBACE contribuiu significativamente para a conclusão antecipada do HGP.

Quarta Inovação: Sequenciação Paralela Massiva

Isto representa um salto substancial em frente, caracterizado pela capacidade de sequenciar DNA de forma massivamente paralela, resultando numa análise rápida e simultânea de múltiplos fragmentos. Uma das características principais do sequenciamento é a sua contribuição significativa para a queda acentuada nos custos de sequenciamento.

FAQ: Criar uma Biblioteca de Sequenciamento

1. Quais são os passos principais envolvidos na construção de uma biblioteca de ADN?

As principais partes da construção de uma biblioteca de ADN envolvem:

• Fragmentação e Reparação das Extremidades: Decompor o DNA em fragmentos manejáveis e reparar as extremidades para garantir uma ligação adequada.
• Ligação: Juntar os fragmentos de DNA reparados a adaptadores ou vetores para sequenciação.
• PCR (Reacção em Cadeia da Polimerase): Amplificação do DNA ligado para aumentar a quantidade para sequenciação.

Nota: Os passos de purificação das esferas estão omitidos aqui.

Além disso, a construção de uma biblioteca a partir de amostras de RNA envolve um passo extra devido à natureza do RNA. É necessário realizar a transcrição reversa do RNA em DNA complementar (cDNA) antes de prosseguir com o processo de construção da biblioteca acima mencionado. No entanto, o princípio fundamental permanece o mesmo.

2. Por que é necessário fragmentar amostras de gDNA antes da preparação da biblioteca para NGS?

Os sequenciadores Illumina normalmente leem fragmentos na faixa de 50-600 pares de bases, embora esta faixa possa variar dependendo dos chips de sequenciação e dos reagentes utilizados. Por outro lado, a maioria das amostras de DNA genómico humano (gDNA) intacto excede 10 quilobases (kb) em comprimento. Portanto, a fragmentação destes grandes fragmentos em pedaços menores é essencial para uma construção de biblioteca bem-sucedida. Este requisito de fragmentação é igualmente válido para a plataforma MGI.

Tabela 1 Comprimentos de Leitura de Sequenciamento Recomendados para Diferentes Aplicações em Plataformas de Sequenciamento Illumina

3. Por que é essencial incorporar um adaptador após a fragmentação do DNA? Qual é a sua importância?

Um adaptador completo compreende três componentes: primers universais (P5 e P7), índice (i7/i5) e primers de sequenciação (SP1 e SP2).

• Primários universais facilitar a geração de clusters, enquanto os primers de sequenciação são essenciais para sequenciar o inserto.
• A sequência de emenda é determinada pela plataforma de sequenciação.
• Indexação serve para diferenciar várias amostras dentro do mesmo lote de dados de sequenciação. Quando se sequenciam várias amostras no mesmo chip (≥2), a indexação é crucial para a discriminação das amostras. No entanto, se apenas uma amostra ocupar uma célula de fluxo, a indexação torna-se desnecessária, embora os primers universais (P5&P7) e os primers de sequenciação (SP1&SP2) continuem a ser essenciais.

Nota: Embora existam vários métodos para adicionar uma junção completa a uma amostra, a sequência da junção da biblioteca resultante permanece consistente. Pretendemos dedicar um artigo para elucidar as diversas estruturas e conexões das junções no futuro.

4. Por que existem bibliotecas com PCR e sem PCR, e qual é a mais prevalente?

A PCR serve como um método para aumentar o volume da amostra. Quando o volume de entrada inicial é insuficiente, a replicação por PCR é necessária para atingir o volume de biblioteca necessário para sequenciação. Por outro lado, um volume de partida suficiente permite concluir a ligação de junções, purificação e sequenciação subsequente sem amplificação por PCR.

No entanto, as bibliotecas de PCR são mais comuns devido a várias razões:

• Volume Inicial Insuficiente: A maioria das amostras carece do volume inicial necessário para a integração direta.
• Estrutura Física Especializada: Bibliotecas não amplificadas por PCR possuem uma junção em forma de Y única, que pode introduzir viés nas avaliações de controlo de qualidade da biblioteca.
• Junções Residuais: A elevada proporção de junções em relação aos modelos e a purificação inadequada resultam em junções residuais significativas, diminuindo a qualidade geral da biblioteca.

5. Por que é que vários kits impõem requisitos distintos para os volumes iniciais de amostra?

A capacidade de volume inicial de um kit depende principalmente da sensibilidade, especificidade e estabilidade das suas respectivas enzimas. Kits destinados a volumes iniciais mais baixos (por exemplo, amostras de swab nasofaríngeo para testes de COVID-19) exigem uma eficácia enzimática superior, refletindo-se, consequentemente, em preços mais elevados. Além disso, kits adaptados para amostras de baixo volume inicial costumam ter patentes exclusivas e vantagens distintas, contribuindo ainda mais para os seus custos elevados. contacte a nossa equipa técnica para mais informações.

Referências:

1. Selvakumar, Sushmaa Chandralekha, et al. "CRISPR/Cas9 e sequenciação de nova geração no tratamento personalizado do Cancro." Câncer Molecular 21.1 (2022): 83.
2. Head, Steven R., et al. "Construção de bibliotecas para sequenciação de nova geração: visões gerais e desafios." Biotécnicas 56.2 (2014): 61-77.