Controlo de Qualidade no Fluxo de Trabalho de Preparação de Bibliotecas de NGS

a preparação das bibliotecas. O sequenciamento de próxima geração (NGS) revolucionou a genómica, permitindo que os investigadores explorassem as complexidades do ADN e do ARN a uma escala sem precedentes. No entanto, o sucesso do NGS depende fortemente da qualidade das bibliotecas preparadas. Para otimizar o tempo e os recursos, verificações de controlo de qualidade (CQ) eficientes são indispensáveis em etapas cruciais do fluxo de trabalho de preparação das bibliotecas. A implementação de medidas de CQ antes e depois de várias fases do processo garante amostras de alta qualidade, minimiza erros dispendiosos e melhora o sucesso geral da preparação das bibliotecas. NGS experiências.

Sequenciação de próxima geração. (Hess et al., 2020)

A Importância da Qualidade da Amostra na Preparação de Bibliotecas de NGS

A preparação de bibliotecas de NGS envolve várias etapas críticas, incluindo fragmentação da amostra, ligação de adaptadores de sequenciação e amplificação da biblioteca. A qualidade das amostras iniciais impacta significativamente o sucesso dessas etapas e, consequentemente, os resultados da sequenciação. Amostras de baixa qualidade ou insuficientemente concentradas podem levar a dados tendenciosos ou pouco fiáveis, potencialmente desperdiçando recursos valiosos e atrasando os resultados da pesquisa. Ao realizar verificações de QC ao longo do processo, os investigadores podem identificar problemas potenciais precocemente e otimizar os seus protocolos para resultados ótimos.

Por favor, consulte o nosso Diretrizes para Submissão de Amostras para mais detalhes.

Controlo de Qualidade do Material de Partida na Preparação de Bibliotecas de NGS

O sucesso do NGS depende fortemente da qualidade dos materiais iniciais utilizados no processo de preparação da biblioteca. O controlo de qualidade (CQ) adequado dos materiais iniciais, seja DNA ou RNA, é o primeiro e crucial passo na preparação de bibliotecas de alta qualidade e na obtenção de resultados de sequenciação bem-sucedidos.

O material de partida, como o DNA genómico ou RNA total, serve como a base para a construção de bibliotecas de NGS. É essencial avaliar a qualidade e a quantidade dessas amostras antes de iniciar a preparação da biblioteca. Materiais de partida de alta qualidade impactam significativamente os processos subsequentes, garantindo dados de sequenciação precisos e representativos. Por outro lado, amostras degradadas ou de baixa qualidade podem levar a resultados enviesados, perda de material valioso de sequenciação e comprometimento da complexidade da biblioteca.

Parâmetros Críticos de QC para Material de Partida:

• Quantidade: A quantificação precisa do material inicial é essencial para determinar a quantidade apropriada necessária para a preparação da biblioteca. Os kits de preparação de bibliotecas para NGS frequentemente recomendam concentrações e quantidades iniciais específicas para otimizar os resultados de sequenciação. A quantificação precisa garante que a biblioteca não seja sub ou sobre-sequenciada, levando a uma cobertura e geração de dados ótimas.
• Pureza: A pureza do material de partida é avaliada medindo as razões de absorbância em comprimentos de onda específicos, tipicamente A260/A280 e A260/A230. Uma razão A260/A280 próxima de 1,8 e uma razão A260/A230 em torno de 2,0 indicam contaminação mínima por proteínas, compostos orgânicos ou sais. Contaminantes podem interferir nas reações enzimáticas durante a preparação da biblioteca, potencialmente afetando a análise subsequente.
• Integridade: A integridade da amostra de ácido nucleico é crucial para uma preparação de biblioteca bem-sucedida. Para amostras de RNA, o número de integridade do RNA (RIN) ou o número de qualidade do RNA (RQN) podem ser determinados utilizando técnicas como a eletroforese capilar. Altas pontuações de RIN/RQN indicam moléculas de RNA intactas, enquanto RNA degradado pode resultar em uma construção de biblioteca fragmentada e enviesada.

Reproduzibilidade: Garantir que o material de partida é reproduzível é essencial, especialmente em estudos com múltiplas amostras. Réplicas da mesma amostra devem produzir valores de QC consistentes para minimizar a variabilidade técnica durante a preparação da biblioteca.

Pontos de Controlo de QC na Preparação de Bibliotecas de NGS

Para garantir dados de sequenciação precisos e fiáveis, é crucial implementar pontos de controlo de qualidade (CQ) em várias etapas do processo de preparação da biblioteca de NGS. Este artigo descreve a importância do CQ em diferentes momentos do fluxo de trabalho para garantir a criação de bibliotecas de alta qualidade para uma sequenciação bem-sucedida.

Pontos de Controlo de QC na Preparação de Bibliotecas de NGS:

• Amostra de QC

A etapa inicial de QC envolve a avaliação da qualidade e quantidade das amostras de ácidos nucleicos iniciais (DNA ou RNA) antes da preparação da biblioteca. A quantificação precisa, a avaliação da pureza e os testes de integridade das amostras são essenciais para evitar a introdução de viés e garantir a representação ideal do material original na biblioteca.

• QC de Fragmentação

Após a quantificação, as amostras passam por fragmentação, dividindo-as em fragmentos de DNA ou RNA menores. O controlo de qualidade nesta fase confirma que o processo de fragmentação foi bem-sucedido e que a distribuição do tamanho dos fragmentos está dentro da faixa desejada para o experimento específico.

• Controlo de Qualidade da Ligação de Splice

Após a fragmentação, os adaptadores de sequenciação são ligados ao DNA ou RNA fragmentado. São realizados controlos de qualidade para validar a eficiência do processo de ligação e garantir que os adaptadores estão incorporados com sucesso, facilitando a ligação adequada à plataforma de sequenciação.

• QC de Amplificação

A amplificação por PCR é um passo crucial para enriquecer a biblioteca com material pronto para sequenciação. As verificações de controlo de qualidade nesta fase confirmam que a amplificação foi bem-sucedida, sem sobre-amplificação ou sub-amplificação, que podem introduzir vieses e afetar a complexidade da biblioteca.

• Deteção de Dimerização de Adaptadores

Durante todo o processo de preparação da biblioteca, é essencial monitorizar e detetar a presença de dímeros de adaptadores. Estes artefatos podem formar-se quando adaptadores em excesso se ligam entre si, reduzindo a representação do material original na biblioteca. São realizados controlos de qualidade para minimizar o conteúdo de dímeros de adaptadores, garantindo uma biblioteca de alta qualidade.

• Controlo de Qualidade de Pooling de Bibliotecas

Em estudos de múltiplas amostras, as bibliotecas são frequentemente agrupadas para sequenciação multiplexada. O controlo de qualidade do agrupamento envolve a quantificação e normalização da concentração de bibliotecas individuais para garantir uma representação igual de cada amostra, maximizando a eficiência da sequenciação e o rendimento dos dados.

QC para a Biblioteca NGS Final

O passo final no processo de preparação da biblioteca de NGS é a amplificação por PCR, um passo crítico que gera cópias suficientes da biblioteca para o sequenciamento subsequente. Durante esta fase, a ligação de adaptadores de sequenciamento ao DNA ou RNA fragmentado é confirmada, e a amplificação por PCR é utilizada para enriquecer os fragmentos de DNA alvo. O controlo de qualidade (CQ) da biblioteca final de NGS é essencial para garantir o sucesso da corrida de sequenciamento, identificar potenciais problemas e obter dados de sequenciamento fiáveis e de alta qualidade.

Importância do QC para a Biblioteca Final de NGS:

A biblioteca final de NGS representa os fragmentos de DNA ou RNA que estão prontos para sequenciação. Avaliar a qualidade da biblioteca nesta fase é crucial, pois determina o sucesso da corrida de sequenciação subsequente. O controlo de qualidade da biblioteca final ajuda a:

• Verificar a Preparação da Biblioteca com Sucesso: Confirmar que a ligadura dos adaptadores de sequenciação e outros passos de preparação da biblioteca foram bem-sucedidos, garantindo que a biblioteca é adequada para sequenciação.
• Detetar Dimers de Adaptadores: Identificar a presença de primers em excesso ou dimers de adaptadores, que podem interferir no processo de sequenciação e levar à má representação da amostra original.
• Avaliar a Eficiência de Amplificação: Determinar se a biblioteca foi amplificada de forma adequada. A sobre-amplificação pode resultar em um aumento de duplicados e vieses, enquanto a sub-amplificação pode levar a uma representação insuficiente e a uma redução no rendimento de sequenciação.
• Otimizar a Pooling de Bibliotecas: Quantificar a concentração e a concentração molar da biblioteca para facilitar o pooling adequado de várias bibliotecas para sequenciação multiplexada, garantindo uma representação igual de cada amostra.

Métodos de QC para a Biblioteca NGS Final:

• Eletroforese: Plataformas de eletroforese automatizadas, como o Bioanalyzer ou o TapeStation, são frequentemente utilizadas para a análise do tamanho dos fragmentos da biblioteca final. A presença de um pico de dispersão da biblioteca limpa confirma a preparação bem-sucedida da biblioteca, enquanto a presença de picos adicionais indica a presença de dímeros de adaptadores ou outros contaminantes.
• Quantificação: Métodos fluorométricos como Qubit ou qPCR podem quantificar com precisão a concentração e a concentração molar da biblioteca, permitindo a mistura precisa de bibliotecas para sequenciação.

Análise da Complexidade da Biblioteca: Técnicas como códigos de barras moleculares ou outras estratégias de indexação podem ser empregues para avaliar a complexidade da biblioteca e detectar duplicados de PCR, que são essenciais para identificar e corrigir potenciais vieses introduzidos durante a amplificação por PCR.

Referência:

1. Hess, Jacob Friedrich, et al. "Preparação de bibliotecas para sequenciação de nova geração: Uma revisão das estratégias de automação." Avanços em biotecnologia 41 (2020): 107537.