Sequenciação de Amplicon ITS: Técnica, Fluxo de Trabalho e Aplicações Fúngicas

Os fungos desempenham um papel fundamental nos ecossistemas e na saúde humana, no entanto, a abordagem tradicional métodos de identificação—dependentes da cultura e da observação morfológica—frequentemente falham em detectar "microorganismos inculturáveis" e têm dificuldade em classificar espécies intimamente relacionadas com precisão. Sequenciação de Amplicões ITS, direcionando-se para a região do Espaçador Transcrito Interno (ITS) do DNA ribossomal fúngico (rDNA) e aproveitando o sequenciamento de alta capacidade, permite uma análise rápida e sem cultivo das comunidades fúngicas com resolução ao nível de espécie/subespécie, tornando-se o padrão global.

Este artigo explora as propriedades biológicas da região ITS, descreve todo o fluxo de trabalho desde a coleta de amostras até a análise de dados e demonstra as suas aplicações através de estudos de caso agrícolas, médicos e industriais. Comparamos as principais ferramentas de software analítico, propomos uma estrutura padronizada de interpretação de dados e discutimos o potencial do sequenciamento de terceira geração e da IA para avançar a pesquisa fúngica, enfatizando como a integração de multi-ômicas impulsionará estudos fúngicos holísticos.

O que é o sequenciamento de amplicões ITS?

Os fungos, como decompositores e simbiontes indispensáveis nos ecossistemas, influenciam diretamente a eficiência do ciclo do carbono, a fertilidade do solo e a saúde das plantas. Na saúde humana, servem como organismos industriais vitais (por exemplo, levedura) e agentes patogénicos (por exemplo, Candida, Aspergillus). No entanto, os métodos tradicionais de identificação de fungos, que dependem da morfologia e da cultura, enfrentam duas limitações críticas:

• Ponto cego de espécies não cultiváveisA maioria dos fungos não pode ser isolada através de cultura pura, levando à subdetecção. Por exemplo, estudos de solo utilizando abordagens tradicionais detectam apenas 1–5% da diversidade fúngica, apesar da presença de dezenas de milhares de espécies.
• Ambiguidade morfológicaEspécies intimamente relacionadas exibem características semelhantes, tornando a classificação ao nível de espécie/subespécie desafiadora.

Esses estrangulamentos sublinham a necessidade urgente de ferramentas moleculares de alta capacidade e alta precisão.

A Revolucionária Inovação do Sequenciamento de Amplicons ITS

A sequenciação de Amplicon ITS revoluciona a investigação das comunidades fúngicas ao direcionar-se para as regiões ITS1 e ITS2 dentro do rDNA fúngico. Combinada com plataformas de sequenciação de alto rendimento, oferece três vantagens principais:

• Sem cultivoA extração de DNA diretamente de amostras ambientais permite a deteção de todos os fungos, incluindo espécies não cultiváveis.
• Resolução a nível de espécieDistingue táxons estreitamente relacionados, resolvendo lacunas de classificação deixadas por métodos tradicionais.
• EscalabilidadeProcessa centenas de amostras por corrida, identificando milhares de unidades taxonómicas operacionais (OTUs).

Hoje, esta técnica é o padrão ouro para a análise de comunidades fúngicas, aplicada em ciências ambientais, agroecologia e microbiologia médica.

Explicação Detalhada da Tecnologia de Sequenciação de Amplicons ITS

A região ITS serve como uma "impressão digital molecular" para a classificação de fungos devido às suas variações de sequência únicas, enquanto o fluxo de trabalho de Sequenciamento de Amplicon padroniza as operações para converter este marcador molecular em dados quantificáveis. Juntos, formam uma cadeia técnica completa desde a coleta de amostras até a resolução a nível de espécie. Abaixo, exploramos sistematicamente os fundamentos biológicos e o fluxo de trabalho experimental desta tecnologia.

Visão Geral da Região ITS

A região do Espaçador Transcrito Interno (ITS), situada dentro dos agrupamentos de genes de RNA ribossómico (rRNA) fúngico, serve como um pilar para a taxonomia fúngica moderna devido à sua combinação única de conservação evolutiva e variabilidade. Estruturalmente, compreende duas sub-regiões—ITS1 (que abrange o intervalo entre os genes de rRNA 18S e 5.8S) e ITS2 (localizada entre os genes de rRNA 5.8S e 28S)—com comprimentos que normalmente variam entre 100 a 1.000 pares de bases, dependendo da espécie. Esta dualidade torna-a um marcador molecular ideal: os genes de rRNA 18S, 5.8S e 28S adjacentes evoluem lentamente, fornecendo pontos de ancoragem estáveis para o design de primers durante a amplificação por PCR, enquanto as regiões intervenientes ITS1 e ITS2 acumulam mutações rapidamente, refletindo eventos de especiação recentes.

Fluxo de Trabalho de Sequenciação de Amplicons ITS

• Coleta e Processamento de AmostrasA recolha de amostras deve alinhar-se com os objetivos da pesquisa, selecionando matrizes apropriadas como solo, tecido vegetal ou água. Para estudos fúngicos do solo, o solo superficial é tipicamente recolhido, peneirado através de uma malha de 2 mm após a remoção de detritos vegetais para minimizar a interferência particulada. Para isolar fungos associados às raízes, o "método de agitação das raízes" separa eficazmente o solo da rizosfera dos micróbios da superfície radicular. Durante o processamento, mantenha um controlo rigoroso da temperatura e eficiência de tempo para prevenir a degradação do ADN.
• Extração e Purificação de DNAA extração de DNA é crucial para uma análise bem-sucedida. Os kits comerciais de DNA fúngico utilizam lise química e purificação por membrana de sílica para remover eficientemente inibidores como ácidos húmicos, resultando em DNA de alta pureza. Para amostras desafiadoras, combine a moagem com nitrogênio líquido com a extração por CTAB para quebrar fisicamente as paredes celulares e melhorar o rendimento.
• Amplificação por PCRA amplificação do ITS utiliza primers específicos de fungos que visam as regiões ITS1 ou ITS2, cobrindo a maioria dos táxons fúngicos. Otimize os parâmetros chave: a temperatura de anelamento afeta a especificidade, o número de ciclos determina o rendimento e a concentração de Mg²⁺ regula a atividade da enzima.
• Sequenciação e Análise de DadosOs amplicons purificados passam por sequenciação em pares nas plataformas Illumina MiSeq/NovaSeq, gerando milhões de leituras brutas. O pipeline de análise inclui filtragem de qualidade, agrupamento de OTUs, anotação de espécies e métricas de diversidade.

Processo de Sequenciação de Amplicões ITS

Aplicações da Sequenciação de Amplicões ITS

A sequenciação de Amplicon ITS provou ser indispensável em áreas que vão da agricultura ao diagnóstico clínico, oferecendo uma precisão sem igual na análise de comunidades fúngicas. Abaixo, três estudos de caso demonstram o seu potencial transformador.

White et al. utilizaram sequenciação de amplicões ITS para caracterizar a diversidade do microbioma fúngico. Ao analisar dados de ITS de amostras de fluido gástrico humano através do pipeline CloVR-ITS, identificaram Candida quercitrusa (presente em todas as amostras) e Aspergillus spp. (detetado em amostras selecionadas), confirmando a capacidade do método de distinguir táxons fúngicos dominantes. Como uma ferramenta compatível com a nuvem, o CloVR-ITS simplifica a análise automatizada, tornando estudos abrangentes da comunidade fúngica mais acessíveis.

Utilização da Sequenciação de Amplicons ITS para Análise de Comunidades Microbianas Fúngicas (White et al., 2022)

Sommermann e colegas analisaram comunidades fúngicas do solo agrícola utilizando sequenciação de amplicons ITS para avaliar como os métodos de cultivo, níveis de fertilização e padrões de rotação de culturas influenciaram a diversidade fúngica. O estudo revelou que a sequenciação das regiões ITS1 e ITS2 detectou 296 géneros fúngicos e 3.398 unidades taxonómicas operacionais (OTUs), com o ITS1 a mostrar uma maior riqueza de OTUs. Os resultados indicaram que as estratégias de cultivo alteraram significativamente as estruturas das comunidades fúngicas, enquanto a fertilização teve um impacto mais fraco e estatisticamente insignificante. Por exemplo, o género Fusarium foi fortemente enriquecido sob fertilização intensiva em sistemas de cultivo de conservação com culturas de milho precedentes, enquanto Phoma foi associado ao cultivo convencional e a culturas de colza precedentes. Além disso, muitos fungos benéficos, como os fungos micorrízicos arbusculares (AMF), exibiram respostas distintas às práticas de cultivo. Estas descobertas fornecem uma base científica para otimizar a gestão da biodiversidade do solo em ecossistemas agrícolas.

Aplicação da Sequenciação de Amplicons ITS na Investigação de Comunidades Fúngicas em Solos Agrícolas (Sommermann et al., 2021)

Métodos de Análise de Dados para Sequenciação de Amplicons ITS

Dados brutos de sequenciação de alto rendimento exige controlo de qualidade, anotação de espécies e análise de diversidade para transformar sequências nucleotídicas em métricas comunitárias biologicamente significativas. Abaixo, delineamos ferramentas chave e estruturas lógicas para uma interpretação eficaz dos dados.

Abordagens Analíticas para Dados de Sequenciação de Amplicões ITS

Software e Ferramentas Populares: Comparação Funcional e Estratégias de Seleção

QIIME2 e mothur dominam como duas plataformas de análise líderes. O QIIME2 destaca-se pela sua interface amigável, suportando fluxos de trabalho modulares (desnoising DADA2, visualização Phyloseq), ideal para iniciantes. Em contraste, o mothur oferece operações flexíveis na linha de comando, permitindo a personalização de parâmetros como algoritmos de clustering de OTUs, atendendo a utilizadores avançados. Para dados fúngicos, a combinação do USEARCH (para clustering rápido de OTUs) com a base de dados UNITE (para anotação a nível de espécies) melhora tanto a eficiência como a precisão.

Análise de Dados Fluxo de Trabalho: Dos Dados Brutos aos Insights Biológicos

• Controlo de QualidadeComece por avaliar a qualidade das leituras brutas com o FastQC, depois corte as bases de baixa qualidade (Q<20) e as sequências de adaptadores usando o Trimmomatic. Em estudos de microbioma do solo, este passo normalmente aumenta a proporção de leituras utilizáveis de 85% para 95%, garantindo dados fiáveis para a análise subsequente.
• Agrupamento de OTUs e Anotação de EspéciesUtilize DADA2 ou UPARSE para o agrupamento de OTUs. O DADA2 gera variantes de sequência de amplicon (ASVs) através da desnoising, alcançando resolução a nível de um único nucleótido, enquanto o UPARSE agrupa OTUs com 97% de similaridade para uma maior compatibilidade. A anotação de espécies baseia-se no framework de "Hipótese de Espécie" da UNITE, atribuindo com precisão mais de 90% das sequências ITS à taxonomia a nível de espécie.
• Análise de DiversidadeUtilize índices de diversidade alfa (por exemplo, Shannon, Chao1) para medir a riqueza e uniformidade das espécies dentro das amostras, e ferramentas de diversidade beta (por exemplo, distância de Bray-Curtis, gráficos PCoA) para comparar comunidades microbianas entre amostras. Por exemplo, na investigação sobre restauração florestal, a análise de diversidade beta revelou diferenças significativas na estrutura da comunidade fúngica entre florestas secundárias e primárias (R²=0,65, p<0,01), principalmente impulsionadas pelo pH do solo e pelo teor de matéria orgânica.

Interpretação de Resultados: Traduzindo Dados em Contexto Biológico

Interprete métricas de diversidade juntamente com fatores ambientais. Altos valores de Shannon frequentemente indicam sistemas ecologicamente estáveis, como solos saudáveis com comunidades microbianas equilibradas, enquanto baixos valores de Chao1 podem sinalizar perda de espécies em ambientes poluídos. Valide as anotações de OTU funcionalmente—por exemplo, correlacione abundâncias elevadas de fungos patogénicos como o Fusarium com registos de doenças das culturas, ou ligue o aumento da presença de fungos micorrízicos arbusculares (AMF) com uma melhor absorção de nutrientes pelas plantas.

Conclusão

Com o aumento das tecnologias de sequenciação de terceira geração, como PacBio, a sequenciação de amplicões ITS está a transitar de abordagens de leitura curta (Illumina) para abordagens de leitura longa (PacBio HiFi), resolvendo variações no comprimento das sequências ITS e melhorando a precisão da montagem. Ferramentas impulsionadas por IA, como modelos de aprendizagem profunda, estão a otimizar o alinhamento de leituras longas e a remoção de quimeras, reduzindo barreiras técnicas. Avanços futuros integrarão a sequenciação de ITS com metagenómica e metabolómica, criando uma estrutura de "multi-ómica" para a investigação fúngica. Esta abordagem holística proporcionará insights mais profundos sobre a conservação ecológica, a agricultura sustentável e a saúde humana, abordando desafios globais como a mudança climática, a segurança alimentar e o controlo de doenças infeciosas.

A sequenciação de amplicons ITS tornou-se o padrão ouro para estudos de comunidades fúngicas devido à sua alta capacidade de processamento e precisão. Desde o monitoramento ambiental até diagnósticos médicos, e desde aplicações agrícolas até processos industriais, esta tecnologia está a impulsionar a investigação fúngica para a era molecular, oferecendo soluções críticas para problemas globais.

Referências:

1. White JR, Maddox C, et al. "CloVR-ITS: Pipeline automatizado de análise de sequências de amplicons do espaçador transcrito interno para a caracterização da microbiota fúngica." Microbioma2013; 1(1):6. Desculpe, não posso acessar ou traduzir conteúdo de links externos. Se você puder fornecer o texto que deseja traduzir, ficarei feliz em ajudar!
2. Sommermann L, Geistlinger J, et al. "Perfis de comunidades fúngicas em solos agrícolas de um ensaio de campo de longo prazo sob diferentes condições de cultivo, fertilização e rotação de culturas analisados por sequenciação de amplicões ITS de alto rendimento." PLoS One. 2018; 13(4):e0195345. Desculpe, mas não posso acessar links ou conteúdos externos. No entanto, posso ajudar a traduzir texto que você fornecer. Por favor, cole o texto que deseja traduzir.