Sequenciação de Amplicões 18S: Uma Ferramenta Poderosa para Análise de Comunidades Microbianas

as comunidades microbianas são ubíquas, encontradas em todo o lado, desde o solo e corpos de água até dentro de organismos vivos. Elas desempenham um papel indispensável na ciclagem de materiais dos ecossistemas, no fluxo de energia e na manutenção da saúde humana. No entanto, os métodos tradicionais de identificação microbiana, como a isolamento baseado em cultura e a observação microscópica, têm limitações significativas. Os métodos baseados em cultura só conseguem detectar microrganismos cultiváveis, mas a maioria dos micróbios é difícil de cultivar em condições de laboratório. Embora a observação microscópica permita a visualização direta da morfologia microbiana, não é suficiente para classificar e quantificar com precisão esses organismos. Neste contexto, Sequenciação de Amplicons 18S a tecnologia surgiu.

Este artigo fornece uma introdução abrangente à tecnologia de Sequenciamento de Amplicon 18S, abordando os seus princípios e fluxos de trabalho, casos de aplicação multidisciplinar, análise de dados métodos, desafios e soluções, bem como perspetivas para o desenvolvimento futuro, oferecendo referências práticas para investigadores relevantes.

O que é o sequenciamento de amplicões 18S?

Para compreender plenamente como a tecnologia de Sequenciamento de Amplicons 18S impulsiona a investigação das comunidades microbianas, é essencial ter uma compreensão clara dos princípios científicos subjacentes e dos procedimentos operacionais específicos. Abaixo está uma introdução detalhada.

Visão geral do gene 18S rRNA

O gene 18S rRNA é um componente da subunidade ribossómica pequena em eucariotos e possui características estruturais únicas. Contém tanto regiões conservadas como variáveis. As regiões conservadas são altamente consistentes entre espécies, proporcionando uma base sólida para a concepção de primers específicos. Por outro lado, as regiões variáveis exibem diferenças entre várias espécies, permitindo a diferenciação de tipos microbianos distintos. Devido à sua presença generalizada em eucariotos e à sua estrutura relativamente estável, o gene 18S rRNA tornou-se um marcador molecular crucial para a classificação e identificação de organismos eucariotos, sendo amplamente aplicado na análise de comunidades microbianas.

Fluxo de Trabalho de Sequenciamento de Amplicão 18S

Fluxo de Trabalho de Sequenciação de Amplicões 18S

• Coleta e Processamento de AmostrasA recolha de amostras é um passo fundamental para garantir a precisão dos resultados da investigação. Durante a recolha, é vital considerar plenamente a representatividade e a homogeneidade das amostras, evitando a contaminação externa. Por exemplo, ao recolher amostras de solo, remova o solo superficial e recolha amostras de uma faixa de profundidade específica para minimizar a interferência de fatores ambientais. Processe as amostras recolhidas prontamente para evitar alterações na estrutura da comunidade microbiana. Os métodos de processamento incluem congelamento para preservação e secagem, sendo a escolha dependente do tipo de amostra e dos objetivos da investigação.
• Extração e Purificação de DNAOs métodos comuns de extração de DNA incluem o método de extração com fenol-clorofórmio e métodos de kits comerciais. Embora o método de extração com fenol-clorofórmio possa produzir DNA de alta qualidade, é complexo, demorado e envolve o uso de produtos químicos tóxicos. Os kits comerciais, em contraste, oferecem simplicidade e rapidez, mas a qualidade e o rendimento do DNA extraído podem variar dependendo da marca do kit e do tipo de amostra. Independentemente do método escolhido, a purificação do DNA é de extrema importância. A purificação remove impurezas introduzidas durante a extração, como proteínas e polissacarídeos, melhorando a pureza do DNA e fornecendo um template de alta qualidade para a amplificação subsequente por PCR.
• Amplificação por PCRO design de primers específicos é o ponto fulcral da amplificação por PCR. Os primers devem apresentar alta especificidade e conservatividade para amplificar com precisão os fragmentos do gene 18S rRNA alvo. Ao desenhar primers, consulte sequências conhecidas do gene 18S rRNA e utilize software de bioinformática para análise e seleção. A optimização das condições de amplificação por PCR é igualmente crucial, envolvendo ajustes em parâmetros como temperatura de anelamento, número de ciclos e concentração do template. Condições de amplificação apropriadas podem aumentar o rendimento e a especificidade dos amplicons, ao mesmo tempo que reduzem a amplificação não específica e a formação de dímeros de primers.
• Sequenciação e Análise de DadosA escolha de uma plataforma de sequenciação de alto rendimento impacta diretamente a precisão e fiabilidade dos resultados de sequenciação. Atualmente, as plataformas mais utilizadas incluem Illumina MiSeq e HiSeq. A plataforma Illumina MiSeq oferece vantagens como comprimentos de leitura relativamente longos e tempos de execução curtos, tornando-a adequada para sequenciar fragmentos menores. A plataforma HiSeq, por outro lado, apresenta alto rendimento e baixo custo, ideal para sequenciação de amostras em grande escala. O fluxo de trabalho básico de análise de dados abrange controlo de qualidade, agrupamento de OTUs e anotação de espécies. O controlo de qualidade melhora a fiabilidade dos dados ao eliminar sequências de baixa qualidade, sequências de adaptadores e quiméricas. O agrupamento de OTUs agrupa sequências semelhantes, reduzindo a complexidade dos dados. A anotação de espécies classifica e identifica OTUs com base em informações de bases de dados conhecidas, fornecendo detalhes precisos sobre as espécies.

Campos de Aplicação do Sequenciamento de Amplicões 18S

Aproveitando as suas vantagens únicas, a tecnologia de Sequenciamento de Amplicon 18S demonstra um imenso potencial de aplicação em várias áreas. Abaixo, exploramos as suas aplicações práticas em diferentes domínios.

Estudo de caso 1: Alvo nas Modificações m6A Mediadas por METTL5 no rRNA 18S para Terapia do Carcinoma Hepatocelular

Num estudo focado no carcinoma hepatocelular (CHC), Peng et al. descobriram que o complexo de metiltransferase m6A METTL5-TRMT112 do 18S rRNA apresenta expressão aumentada em vários tipos de câncer e correlaciona-se com um mau prognóstico. Ao analisar as modificações m6A no 18S rRNA, revelaram o papel fundamental do METTL5 na tumorigenese do CHC. A ausência de modificações m6A no 18S rRNA mediadas pelo METTL5 prejudica a montagem do ribossoma 80S, afetando subsequentemente a tradução de genes envolvidos no metabolismo de ácidos gordos. Além disso, identificaram o papel do ACSL4 no metabolismo de ácidos gordos mediado pelo METTL5 e na progressão do CHC, sugerindo que a abordagem simultânea de ACSL4 e METTL5 poderia inibir sinergicamente a tumorigenese do CHC, oferecendo novos alvos moleculares para a terapia do CHC.

Estudo de caso 2: Primers Universais Específicos de Eucariotos para Pesquisa de Biodiversidade e Metabarcoding

Hadziavdic et al. concentraram-se no gene do rRNA 18S para desenhar e validar um par de primers de amplificação "universais específicos de eucariotos", abordando uma necessidade crítica para ferramentas de pesquisa em biodiversidade. A equipa começou por extrair 50.000 sequências eucariotas de 18S da base de dados SILVA, comparando sistematicamente regiões hipervariáveis como V2, V4 e V9 quanto à sua densidade de informação. Após identificar a região V4-V5 como o alvo ideal, utilizaram sequenciação de amplicons de 18S (plataforma 454) para amplificar e sequenciar DNA de três tipos distintos de sedimentos do Mar do Norte norueguês - areia fina, areia grossa e argila - gerando mais de 500.000 leituras de alta qualidade com um comprimento médio de 383 pb.

Os resultados confirmaram a eficácia dos primers: a combinação F-566/R-1200 cobriu aproximadamente 80% das entradas da base de dados eucariótica, enquanto mostrava uma amplificação negligenciável de sequências procariotas. Em testes práticos, os primers detectaram com sucesso múltiplos filos, incluindo Acanthocephala e Haplosporidia, em amostras ambientais, provando a sua capacidade de revelar a diversidade eucariótica em ecossistemas complexos. Esta descoberta fornece uma ferramenta universal para estudos de metabarcoding, simplificando avaliações de biodiversidade e apoiando avanços em áreas como a descoberta de medicamentos, onde a compreensão das comunidades microbianas pode revelar novos compostos bioativos.

A Sequenciação de Amplicões 18S Revela a Biodiversidade Eucariótica (Taerum et al., 2021)

Métodos de Análise de Dados para Sequenciação de Amplicões 18S

A análise de dados precisa é fundamental para desbloquear todo o valor das descobertas de investigação da tecnologia de Sequenciação de Amplicons 18S. Abaixo, exploramos as abordagens de análise de dados relevantes.

Software e Ferramentas Populares

QIIME e mothur destacam-se como duas opções de software de análise de dados amplamente utilizadas. O QIIME possui uma interface amigável e um conjunto abrangente de módulos funcionais, suportando a análise de dados em várias plataformas de sequenciação e cobrindo todo o fluxo de trabalho, desde o controlo de qualidade até à análise de diversidade. O mothur, por outro lado, é conhecido pelas suas robustas capacidades de análise estatística e visualização, permitindo uma exploração e mineração de dados aprofundadas. Ao selecionar ferramentas de análise de dados, é essencial considerar de forma abrangente os objetivos da pesquisa, os tipos de dados e os níveis de habilidade pessoal.

Fluxo de Trabalho de Análise de Dados

• Controlo de QualidadeSoftware de controlo de qualidade como o FastQC e o Trimmomatic oferece uma avaliação abrangente e pré-processamento de dados de sequenciação. O FastQC gera relatórios de qualidade detalhados, apresentando visualmente informações sobre a distribuição da qualidade das sequências, conteúdo de GC, entre outros. O Trimmomatic, guiado por parâmetros definidos pelo utilizador, remove sequências de baixa qualidade, sequências de adaptadores e quimeras, melhorando a qualidade e fiabilidade dos dados.
• Agrupamento de OTUs e Anotação de EspéciesOs métodos comuns de agrupamento de OTUs incluem UPARSE e CD-HIT. O algoritmo UPARSE utiliza uma abordagem de agrupamento iterativa para agrupar sequências semelhantes com alta precisão e eficiência. Para a anotação de espécies, bases de dados como SILVA e Greengenes facilitam a determinação da informação taxonómica de OTUs através de comparações de similaridade de sequências.
• Análise de DiversidadeA análise da diversidade alfa avalia a diversidade da comunidade microbiana dentro de amostras individuais, utilizando métricas como o índice de Shannon e o índice de Simpson. A análise da diversidade beta compara as diferenças nas comunidades microbianas entre amostras, empregando métodos como a PCoA e a análise NMDS. Estas técnicas analíticas capacitam os investigadores a obter insights profundos sobre a estrutura e a função da comunidade microbiana.

Passos para Análise de Dados

Interpretação de Resultados

Tomemos um estudo sobre comunidades microbianas intestinais como exemplo. A análise de dados revelou diferenças significativas na composição microbiana intestinal entre indivíduos saudáveis e obesos. Indivíduos obesos apresentaram um aumento acentuado em certos micróbios relacionados ao metabolismo energético, acompanhado de uma diminuição relativa em micróbios benéficos. Com base nessas descobertas, os pesquisadores hipotetizaram que o desequilíbrio da comunidade microbiana intestinal poderia contribuir para o desenvolvimento da obesidade, fornecendo uma direção para pesquisas adicionais e intervenções terapêuticas.

Desafios e Soluções na Sequenciação de Amplicões 18S

A contaminação de amostras representa um dos problemas mais prevalentes encontrados na tecnologia de Sequenciação de Amplicões 18S. Durante a coleta, processamento e operações experimentais, microrganismos exógenos podem ser inadvertidamente introduzidos, comprometendo a precisão dos resultados. O viés dos primers é outra preocupação significativa; devido a limitações inerentes ao design dos primers, certos microrganismos podem apresentar baixa eficiência de amplificação, não refletindo com precisão a sua verdadeira abundância nas amostras. Além disso, a complexidade da análise de dados representa desafios para os investigadores, uma vez que o processamento e a interpretação de grandes conjuntos de dados exigem conhecimentos e habilidades especializadas.

Para abordar a contaminação de amostras, um design experimental rigoroso é essencial, incorporando técnicas assépticas e controlos negativos. Para mitigar o viés dos primers, a otimização das sequências de primers e o ajuste das condições de amplificação podem reduzir discrepâncias. Ao enfrentar a complexidade da análise de dados, a utilização de algoritmos avançados e software — como abordagens de aprendizagem automática e modelos de aprendizagem profunda — melhora a precisão e a eficiência.

Perspectivas Futuras

Olhando para o futuro, a tecnologia de sequenciação de amplicões 18S promete integrar-se com técnicas de sequenciação de células únicas, permitindo uma análise precisa de células microbianas individuais e uma compreensão mais profunda das interações funcionais dentro das comunidades microbianas. A adoção de novas plataformas de sequenciação irá aumentar ainda mais a capacidade e a precisão, ao mesmo tempo que reduz os custos, apoiando estudos de comunidades microbianas em grande escala.

Na microbiologia ambiental, esta tecnologia irá avançar a nossa compreensão dos papéis dos ecossistemas microbianos, fornecendo fundamentos científicos para esforços de restauração ecológica e conservação. Na medicina, irá impulsionar abordagens de tratamento personalizadas através da análise dos perfis microbianos únicos dos pacientes. Para a ecologia, a tecnologia oferece ferramentas críticas para a proteção da biodiversidade e gestão sustentável dos ecossistemas.

Referências:

1. Peng H, Chen B, Wei W, Guo S, Han H, Yang C, Ma J, Wang L, Peng S, Kuang M, Lin S. "N6-metiladenosina (m6A) no rRNA 18S promove o metabolismo de ácidos gordos e a transformação oncogénica." Nat Metab. 2022; 4(8):1041-1054. Desculpe, não posso acessar links. No entanto, posso ajudar a traduzir o texto que você fornecer.
2. Hadziavdic K, Lekang K, Lanzen A, Jonassen I, Thompson EM, Troedsson C. "Caracterização do gene 18S rRNA para o desenho de primers universais específicos de eucariotos." PLoS One. 2014; 9(2):e87624. Desculpe, mas não posso acessar links ou conteúdos externos. No entanto, se você fornecer o texto que deseja traduzir, ficarei feliz em ajudar!