Melhores Práticas para Extração de DNA de Alto Peso Molecular para Sequenciação de Longas Leituras

Por que o DNA de Alto Peso Molecular é Importante para o Sequenciamento de Longas Leituras

Tecnologias de sequenciação de leitura longa, como PacBio e Oxford Nanopore Technologies (ONT) dependem fortemente da integridade e comprimento do DNA de entrada para fornecer leituras de alta qualidade. Ao contrário das plataformas de leitura curta, que processam fragmentos de DNA de 100 a 300 pares de bases, os sistemas de leitura longa podem lidar com fragmentos que abrangem dezenas a centenas de quilobases (kb)—desde que o DNA de entrada esteja suficientemente intacto.

O DNA de alto peso molecular (HMW), tipicamente definido como fragmentos superiores a ~50 kb (e potencialmente ultrapassando 100 kb), oferece várias vantagens cruciais:

• Contiguidade melhorada da montagem do genoma.

No seu estudo marcante, Jain et al. (2018) (DOI: Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça-o e terei o prazer de ajudar na tradução.) utilizou sequenciação Nanopore com leituras ultra-longas (N50 > 100 kb, até 882 kb) para montar um genoma de referência humano (GM12878) com contiguidade significativamente melhorada. A adição destas leituras longas aumentou a métrica NG50 de ~3 Mb para ~6.4 Mb, permitindo uma cobertura mais completa e resolução de lacunas.

Sequenciação e montagem de um genoma humano com leituras ultra-longas por nanopore (Jain) et al.. 2018).

• Deteção melhorada de variantes estruturais.

Leituras mais longas abrangem regiões complexas ou repetitivas, permitindo a deteção de grandes inserções, deleções e rearranjos—frequentemente perdidos por leituras curtas fragmentadas.

• Faseamento de alta confiança e insights epigenéticos.

Fragmentos longos e contíguos suportam a fase de alelos ao longo de quilobases e preservam modificações nativas do DNA (por exemplo, metilação), essenciais para estudos genómicos avançados.

Em essência, adquirir DNA de HMW não é opcional—é a base para gerar leituras ultra-longas que desbloqueiam todas as capacidades do sequenciamento de long-read. Técnicas que comprometem o comprimento ou a integridade do DNA limitam intrinsecamente o comprimento das leituras, a qualidade da montagem e a perceção genómica.

Desafios na Isolação de DNA de Alto Peso Molecular (HMW)

A extração de DNA HMW adequada para sequenciação de long-read é tecnicamente exigente. Vários desafios críticos podem comprometer a integridade do DNA e afetar a qualidade dos dados subsequentes:

Corte Mecânico e Fragmentação de DNA

Forças de cisalhamento elevadas provenientes de pipetagem agressiva, vortexação ou centrifugação rápida podem fragmentar significativamente cadeias longas de ADN. Um protocolo abrangente para Chlamydomonas reinhardtii demonstrou que minimizar o manuseio físico—especialmente eliminando a vortexação e utilizando pontas de pipeta de grande diâmetro—ajuda a preservar tamanhos de fragmentos superiores a 50 kb, verificado através de eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) (Frédéric Chaux) et al.,. 2024).

Ciclos de Congelamento e Descongelamento

Ciclos repetidos de congelação e descongelação enfraquecem as moléculas de DNA através da formação de cristais de gelo, causando rupturas. As diretrizes de preservação recomendam limitar a congelação e descongelação e preferir o armazenamento a 4 °C para uso a curto prazo ou a −80 °C para armazenamento a longo prazo.

Contaminantes da Lise e da Matriz da Amostra

Substâncias como proteínas, polissacarídeos, fenólicos ou reagentes de lise residuais podem inibir o sequenciamento ou levar a DNA fragmentado. Amostras de plantas e fungos são especialmente propensas: protocolos que utilizam CTAB + β-mercaptoetanol demonstraram uma pureza melhorada e alta integridade em amostras com alto teor de polissacarídeos.Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça-o e ficarei feliz em ajudar com a tradução.).

Lise Inadequada e Danos Químicos

A lise incompleta leva a rendimentos baixos, mas tampões agressivos ou procedimentos prolongados podem degradar o DNA. Por exemplo, o β-mercaptoetanol ajuda a reduzir danos oxidativos e inibe DNases—mas deve ser equilibrado para evitar prejudicar o DNA com reagentes em excesso.

Kits Padrão Não Otimizados para DNA de HMW

Muitos kits comerciais baseados em colunas de centrifugação ou esferas são eficientes para fragmentos pequenos, mas resultam em DNA fragmentado muito abaixo da faixa desejada de 50–100 kb. As notas técnicas da Oxford Nanopore e da PacBio recomendam protocolos específicos para HMW (por exemplo, Nanobind) para preservar fragmentos ultra-longos.

Resumo dos Pontos de Falha e Riscos

Juntos, estes fatores sublinham que a extração de DNA de alto peso molecular não é rotineira—requer protocolos otimizados, ajustes específicos para cada amostra e manuseio deliberado para manter a integridade do DNA para sequenciação de longas leituras.

Explore os nossos métodos gerais de extração de DNA →

Preparação de Amostras: Escolhendo o Material de Partida Adequado

A seleção e manuseamento cuidadosos do material biológico inicial são essenciais para uma extração bem-sucedida de ADN HMW. Abaixo estão os fatores-chave a considerar:

Tipo de Amostra e Coleta

Diferentes tipos de amostras—como tecido fresco, amostras congeladas, pellets celulares, sangue e material microbiano ou vegetal—variam na facilidade de extração de DNA de alto peso molecular.

Tecidos vertebrados (ex.: músculo, baço): A PacBio recomenda tecido fresco processado dentro de 24 horas a 4 °C ou amostras congeladas rapidamente armazenadas a –80 °C para preservar a integridade do DNA.

Amostras de sangueO sangue total com anticoagulantes como K2-EDTA deve ser processado ou congelado rapidamente e utilizado dentro de poucos dias a 4 °C, ou armazenado a –80 °C.pacb.com).

Amostras microbianas, de plantas ou de insetosCada um requer ajustes de protocolo—PacBio destaca métodos de homogeneização suaves, como o TissueRuptor para insetos e a moagem com azoto líquido para tecidos vegetais resistentes.pacb.com).

Melhor Prática: O congelamento rápido ou o armazenamento a frio imediato minimiza a atividade enzimática e a degradação do DNA em todos os tipos de amostras.

Quantidade e Qualidade de Entrada

A quantidade ideal de entrada varia consoante o tipo de amostra e o método de extração:

Sangue, células cultivadas, células bacterianasO kit Nanobind PanDNA da PacBio funciona bem com 1–5 milhões de células ou 200–400 µL de sangue total, produzindo 3–30 µg de DNA de alta massa molecular (HMW) com tamanhos de fragmentos superiores a 100 kb.

Tecidos vegetaisA preparação de amostras com isolamento de núcleos produz os melhores resultados. Volumes de entrada de 0,25 a 5 g de núcleos de plantas geralmente geram grandes fragmentos de ADN (>100 kb).

Insight chave: Uma massa de entrada adequada garante tanto o rendimento como a integridade do DNA, apoiando a sequenciação de longas leituras a montante.

Orientação Específica para Amostras

Seleção de Protocólos: Métodos Comprovados para Extração de DNA de Alto Peso Molecular

Selecionar o protocolo de extração correto é fundamental para preservar DNA de alto peso molecular (HMW) adequado para sequenciação de leitura longa. Aqui estão métodos comprovados, apoiados por pesquisa, otimizados para as plataformas PacBio e Oxford Nanopore:

Kits de Disco Magnético Nanobind (PacBio)

A PacBio recomenda Kits Nanobind CBB e PanDNA com tecnologia de disco magnético para isolar suavemente DNA de alto peso molecular (HMW) em uma variedade de tipos de amostras—sangue, células, tecido, núcleos de plantas e insetos—tudo dentro de ~1–2,5 horas e produzindo fragmentos de 50–300+ kb.

Vantagens principais: Estresse mecânico mínimo devido à ligação baseada em disco, inclusão de um Eliminador de Leituras Curtas (SRE) para remover fragmentos menores (<10 kb) e compatibilidade com os fluxos de trabalho de sequenciação PacBio HiFi e Nanopore.

2. Lise Suave com Isolamento de Núcleos e Controlo de CTAB/Pipetagem

Para amostras de plantas e insetos, a isolamento inicial de núcleos (por exemplo, através de tampão CTAB e beta-mercaptoetanol) seguido de extração baseada em Nanobind pode preservar ADN ultra-longo. Um estudo de caso sobre Fraxino comum e Taxus baccata usou este protocolo para recuperar eficientemente núcleos de plantas e obter com sucesso fragmentos de ~100 kb tanto para sequenciação ONT como para PacBio HiFi.

Utilize pontas de grande diâmetro ou mistura com pipeta; vortex apenas durante a resuspensão inicial—sem agitação brusca posteriormente.

3. Extração de Fenol-Cloroformo com Encastramento em Plugue de Agarose

Historicamente utilizado para genomas microbianos e amostras metagenómicas desafiadoras, este método envolve a incorporação de amostras em plugs de agarose, realizando lise suave, extração com fenol-clorofórmio e digestão com agarase para liberar o DNA.

• Prós: Capaz de gerar fragmentos de DNA extremamente longos (>200 kb).
• Contras: Trabalho intensivo, risco de danos UV, oxidação de fenol e remoção incompleta de contaminantes.

4. Kits Comerciais de Coluna de Spin: Não Recomendados para DNA de Alto Peso Molecular

Kits de spin convencionais (por exemplo, colunas de sílica ou kits de esferas magnéticas) frequentemente introduzem cisalhamento mecânico, resultando em DNA fragmentado inadequado para sequenciação de longas leituras.

5. Técnicas de Manuseio de Melhores Práticas

Através de todos os métodos, adira a estas práticas essenciais:

Utilize pontas de pipeta de grande diâmetro. e evitar a formação de vórtices após a lise inicial para reduzir o cisalhamento.

Utilize tubos de baixa ligação. (e.g., Eppendorf Protein LoBind) para reduzir a perda de ADN.

Minimizar ciclos de congelação-descongelaçãoe resuspenda o DNA suavemente à temperatura ambiente durante várias horas para uma melhor solubilidade.

Monitorizar o uso do buffer de extração antes e depois da lise para manter um rendimento e integridade ótimos.

Tabela de Visão Geral: Protocolos Comparados

Estes métodos otimizados garantem que você obtenha DNA de HMW com comprimento e pureza suficientes, permitindo resultados de sequenciação de longas leituras de alta qualidade.

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Explorar a extração de DNA de FFPE e limitações

Controlo de Qualidade: Medição do Tamanho e Integridade do DNA Extraído

Garantindo DNA de alto peso molecular (HMW) está intacto e puro antes da sequenciação é essencial para dados de long-read fiáveis. Aqui estão os principais passos e medições de controlo de qualidade utilizados em laboratórios de investigação e instalações centrais:

Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE)

PFGE continua a ser o padrão ouro para separar grandes fragmentos de DNA—variando de dezenas a centenas de quilobases. Resolve fragmentos de até ~2 megabases, proporcionando confirmação visual da integridade do DNA de alto peso molecular. O PFGE é especialmente útil no início da preparação para detectar fracionamento, orientando ajustes nos métodos de extração.

2. Analisador de Fragmentos (Eletroforese Capilar)

Sistemas como Agilent TapeStation e Analisador de Fragmentos automatizar a medição e avaliação da pureza do ADN.

O Fragment Analyzer fornece um Número de Qualidade Genómica (GQN)—a percentagem de DNA acima de um limiar definido—oferecendo um controlo de qualidade quantitativo para a extração de HMW.

Estas ferramentas são amplamente utilizadas devido à rapidez (15–30 minutos por corrida), capacidades de multiplexação e requisitos mínimos de amostra (~1–5 µL).

3. Espectrofotometria e Fluorometria (Nanodrop e Qubit)

Nanodrop fornece rácios de pureza: OD260/280 (~1.8) e OD260/230 (~2,0–2,2). Estes indicam contaminantes de proteínas ou orgânicos, que podem inibir a preparação da biblioteca ou reduzir o comprimento da leitura.

Ensaios de qubits medir a concentração de DNA de cadeia dupla com precisão, ao contrário do Nanodrop, que pode ser influenciado por RNA ou nucleotídeos livres.

Métricas de QC Recomendadas

Dica para Preparação de Leituras Longas

Combine avaliações qualitativas (PFGE) e quantitativas (DIN/GQN, Nanodrop/Qubit) para verificar totalmente a integridade do DNA. A deteção precoce de fracionamento permite a remediação—como reextração ou seleção de tamanho—para preservar o rendimento de leituras longas.

Dicas de Armazenamento e Manuseio para Preservar a Integridade do DNA

O armazenamento e manuseio adequados são fundamentais para manter DNA de alto peso molecular (HMW) qualidade para sequenciação de long-read. Abaixo estão as melhores práticas baseadas em evidências para preservar o comprimento e a pureza dos fragmentos de DNA:

1. Minimizar Ciclos de Congelamento e Descongelamento

O congelamento e descongelamento repetido de amostras de DNA pode fragmentar cadeias de alto peso molecular devido à formação de cristais de gelo e ao stress mecânico. A pesquisa sobre a extração de DNA de leitura longa enfatiza a importância de evitar tais ciclos, através de alíquota de amostras, armazenando-os de forma consistente a –20 ou –80 °C, e trabalhando apenas com um alíquota de cada vez.

2. Armazenamento a Temperatura Óptima

• A curto prazo (semanas a alguns meses): Armazenar DNA de alto peso molecular a 4 °C em uma solução tamponada como 10 mM Tris-HCl (pH 8–9) para manter a estabilidade sem danos por congelamento e descongelamento.
• A longo prazo (vários meses ou mais): Utilize armazenamento a –20 °C ou –80 °C, garantindo o fracionamento para evitar ciclos de descongelação repetidos.

3. Práticas de Manuseio Suave

• Utilize sempre pontas de pipeta de grande diâmetro e pipete lentamente e de forma mínima para reduzir danos mecânicos aos fragmentos de DNA.
• Evite a formação de vórtices; misture as amostras por inversão suave ou batendo levemente.
• Utilize tubos de baixa ligação ou tubos Protein LoBind para evitar que o DNA se cole às paredes dos tubos, especialmente durante armazenamento prolongado.

4. Uso de Buffer e Considerações de Envio

• Armazene o DNA numa solução neutra e tamponada (por exemplo, solução tampão Tris-HCl) em vez de água para evitar a degradação devido a flutuações de pH.
• Para envio ou armazenamento a longo prazo, recomenda-se o gelo seco, e as amostras devem permanecer congeladas para reduzir a agitação e o stress mecânico.

Resumo da Estratégia de Armazenamento

Dica Prática para Fluxos de Trabalho em Laboratório

Estabelecer um protocolo de gestão de amostras isso inclui rotular alíquotas com data/volume, rastrear a história de congelamento/descongelamento e usar consumíveis pré-arrefecidos para manter temperaturas consistentes durante a transferência ou preparação.

Estas melhores práticas garantem que o seu DNA HMW mantenha o integridade necessária para leituras ultra-longasmaximizando a precisão de sequenciação e a qualidade da montagem subsequente.

Destaque da Aplicação: Requisitos das Plataformas PacBio vs. Nanopore

Ao projetar um projeto de sequenciação de leitura longa, é importante compreender as características de cada plataforma. Necessidades de entrada de DNA e requisitos de qualidade é fundamental. Abaixo está uma comparação concisa entre PacBio e Oxford Nanopore, destacando como DNA de alto peso molecular (HMW) apoia o desempenho ideal de cada sistema.

PacBio (Requisitos da Biblioteca SMRTbell)

PacBio's Fluxo de trabalho de sequenciação HiFi exige DNA de alta qualidade, HMW:

• Integridade do DNA: A maioria dos fragmentos deve exceder 30–50 kb, conforme medido pelo Femto Pulse ou PFGE.
• Massa Mínima de Entrada:
• Sequel I: ~150 ng gDNA (>30 kb)
• Sequel II/IIe: ~400 ng gDNA (>30 kb) por biblioteca singleplex.
• Rendimento da Biblioteca: Uma biblioteca típica de célula única ou multiplex com ~400–1.000 ng de entrada pode gerar um template suficiente para uma SMRT Cell 8M, fornecendo >10 Gb de dados.
• Amplicons de Genoma Inteiro: Para bibliotecas de amplicons de 10 kb (por exemplo, plataforma Revio), uma entrada de ≥100 ng de DNA amplificado é adequada para ≥2 Células SMRT com química SPRQ.

O protocolo da PacBio enfatiza o controlo de qualidade do comprimento dos fragmentos (>30 kb) e a quantificação precisa da entrada para garantir um rendimento ótimo e sequenciação de alta fidelidade.

Oxford Nanopore (Kits de Ligação vs. Kits Rápidos)

A Oxford Nanopore oferece kits flexíveis adaptados para aplicações de leituras longas:

• Kit de Sequenciação por Ligação:
• ~1 µg de gDNA HMW; pode trabalhar com 100–500 ng.
• Tempo de Preparação da Biblioteca: ~65 minutos; a fragmentação é opcional se for utilizado ADN HMW.
• Estratégia de Carregamento: Para bibliotecas >10 kb, carregar 800–1.500 ng melhora a ocupação dos poros e o rendimento de dados (~8–10 Gb) em plataformas de alto rendimento.
• Kits de Sequenciação Rápida:
• ~100–400 ng de gDNA HMW (>30 kb) para fragmentos longos e ultra-longos.
• Fluxo de trabalho: baseado em transposase, preparação em menos de 10 minutos; menos etapas de pipetagem preservam a integridade dos fragmentos.

Os comprimentos médios e medianos de leitura da Nanopore (20–30 kb, às vezes >50 kb) e o rendimento da biblioteca dependem fortemente da qualidade inicial do DNA e da minimização do manuseio de fragmentos ultra-longos.

Tabela de Comparação de Chaves

Escolhendo o Caminho Certo

• Para projetos centrados na precisão (por exemplo, montagem de novo, chamada de variantes), o HiFi da PacBio oferece uma precisão inigualável—desde que o DNA de entrada cumpra os requisitos de integridade.
• Para leituras ultra-longas (por exemplo, resolução de telómeros, variantes estruturais), os kits Rapid/Ultra-long da Nanopore emparelhados com uma preparação ultra-suave oferecem as leituras mais longas disponíveis.
• A disponibilidade de amostras pode ditar a escolha do kit: os fluxos de trabalho de ligadura toleram entradas mais baixas, enquanto os métodos HiFi e ultra-longo requerem DNA maior e intacto.

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Resolução de Problemas: Baixo Rendimento ou Fragmentação? Aqui Está o Que Fazer

Mesmo com protocolos otimizados, podem surgir desafios como baixo rendimento de DNA ou fragmentação excessiva durante a extração de DNA de alto peso molecular (HMW). Aqui está um guia prático de resolução de problemas para abordar questões comuns e melhorar os resultados:

1. Baixo Rendimento de DNA

Causas Possíveis e Soluções:

• Lise Ineficiente / Degradação por Nuclease
• Assegure a lise completa da célula ou tecido incubando adequadamente com Proteinase K ou RNase A.
• A digestão prolongada pode aumentar o rendimento e reduzir a interferência de nucleases.

Perda de Amostras Durante a Limpeza

• Quando a concentração de DNA pós-extração (Qubit) é significativamente inferior à do NanoDrop, o RNA residual ou o DNA de cadeia simples podem estar a inflacionar as leituras do NanoDrop.
• Tratar com RNase e Exonuclease VII, depois purificar com esferas AMPure PB de 0,45× para remover contaminantes (de acordo com as recomendações da PacBio).

Baixa Quantidade de Entrada

Para amostras que contêm células raras ou pequenos fragmentos de tecido, considere agrupar ou utilizar protocolos de extração de baixo input, como o kit Nanobind PanDNA ou fluxos de trabalho especializados para plantas/insetos.

2. Fragmentação ou Ruptura do DNA

Deteção e Soluções:

• Deteção de Fragmentação
• Execute PFGE, TapeStation ou Fragment Analyzer para avaliar a distribuição do tamanho. Uma mancha abaixo do alvo indica cisalhamento.
• Fontes Comuns de Stress Mecânico
• Evite a formação de vórtices, pipetagem rápida ou centrifugação a altas velocidades. Utilize pontas de larga abertura e inversão suave.
• Corte Enzimático ou Químico
• A superdigestão ou reagentes agressivos podem danificar o DNA. Use tampões com antioxidantes (por exemplo, beta-mercaptoetanol) e limite o tempo de exposição.

3. Contaminação por RNA, Proteínas ou Reagentes

Identificação e Limpeza:

• Métricas de Pureza
• A260/280 < 1,8 ou A260/230 < 2,0 indica contaminação. Limpe com purificação baseada em esferas ou extração com fenol-clorofórmio (com cautela).
• Carregamento de Proteínas ou Reagentes
• Pellet visível durante a extração sugere remoção incompleta. Inclua uma lavagem extra com etanol ou utilize as lavagens padronizadas da Nanobind.

4. Problemas de Rendimento Específicos da Plataforma

Sequenciação SMRT da PacBio

O baixo comprimento de leitura da polimerase ou o rendimento total podem ser devido à contaminação da biblioteca ou sobrecarga. Monitorize as métricas P0, P1, P2 no SMRT Link e otimize a quantidade de DNA por célula SMRT.

Sequenciação ONT

A ocupação de poros e a taxa de transferência subótimas podem indicar fragmentos demasiado curtos. Utilize kits de reparação de DNA e fragmentação suave opcional (por exemplo, Covaris g-Tubes) para melhorar as sugestões de N50 de leitura da ONT.

5. Inibidores ou Contaminação Ambiental

Contaminação de DNA Ambiental

• Amostras de baixo input estão em risco de contaminação de fundo; inclua sempre negativos/controlos em branco durante a extração.

Qualidade do Reagente

• Utilize reagentes certificados livres de nucleases e DNA. Filtrar ou autoclavar os tampões para prevenir contaminação microbiana ou química.

Tabela de Referência para Resolução de Problemas

A resolução adequada de problemas garante que as suas preparações de DNA HMW atendam consistentemente aos padrões de qualidade necessários para sequenciação de longas leituras de alta fidelidade.

Consulte a resolução de problemas na extração de DNA FFPE →

Referências:

1. Jain, M., Koren, S., Miga, K. H., Quick, J., Rand, A. C., Sasani, T. A., Tyson, J. R., … Loose, M. (2018). Sequenciação e montagem de um genoma humano com leituras ultra-longas por nanopore. Nature Biotechnology, 36(4), 338–345.
2. Pacific Biosciences (2024). Guia e visão geral – Kit Nanobind PanDNA. Obtido da documentação da PacBio.
3. Pacific Biosciences (2024). Guia e visão geral – Kit Nanobind CBB. Obtido da documentação da PacBio.
4. Protocols.io (2019). Eletroforese em Gel de Campo Pulsado para Sequenciação de Longa Leitura [Protocolo].
5. Blog da PacBio (2025). Dicas de extração de DNA e melhores práticas para sequenciação HiFi.
6. Bellott, D., Ting-Jan, C., Ting-Jan, C., Skaletsky, H., Hughes, J., & Page, D. (2022). SHIMS 3.0: Mapeamento e sequenciação iterativa de haplótipos únicos altamente eficientes utilizando leituras de nanoporo ultra-longas. PLoS One, 17(6), e0269692.
7. Dicas e melhores práticas para extração de DNA para sequenciação HiFi - PacBio. Desculpe, não posso acessar links. No entanto, posso ajudar a traduzir texto que você fornecer.