Visão Geral da Pesquisa Exosme

Vesículas Extracelulares (EVs), comumente referidas como exossomas, são uma característica ubíqua no domínio da biologia celular. A pesquisa demonstrou firmemente que estas vesículas não são apenas secretadas por células eucarióticas, mas também são produzidas por todas as células procarióticas, ampliando a sua prevalência. Dentro de organismos multicelulares, os exossomas são disseminados em uma variedade de fluidos corporais, abrangendo sangue, urina, saliva, leite materno, líquido amniótico, ascite, líquido cefalorraquidiano, bile, sêmen e mais.

Estas vesículas são frequentemente referidas por diferentes nomes na literatura científica, com base na sua origem, natureza e características. Embora não exista uma definição universalmente aceite, há uma categorização geral que distingue entre exossomas, vesículas de desprendimento, micropartículas e microvesículas (MV), que normalmente variam em tamanho de 150 a 1000 nanómetros e são formadas através de brotamento da membrana celular. Em contraste, os exossomas são um subtipo de EVs caracterizados pela sua estrutura de membrana de bicamada lipídica. Têm um diâmetro de aproximadamente 30-100 nanómetros e são formados intracelularmente dentro de corpos multivesiculares (MVBs) através da fusão de múltiplos endossomas com a membrana celular.

Composição dos Exossomas

Os exossomas compreendem uma variedade diversificada de componentes. Em 1981, Trams e colegas conceptualizaram pela primeira vez a ideia de exossomas quando descobriram vesículas secretadas por células que exibiam atividade enzimática extracelular. Este conceito foi posteriormente aplicado a vesículas liberadas durante a diferenciação de reticulócitos, que normalmente têm um diâmetro que varia entre aproximadamente 30 a 100 nanómetros. Ao longo dos anos seguintes, tornou-se evidente que vários tipos de células, incluindo linfócitos B, células dendríticas, células T, mastócitos, células neuronais, células endoteliais e células epiteliais, podem secretar exossomas. Além disso, múltiplos fluidos corporais, como sangue, urina, saliva, leite materno, líquido amniótico, ascite, líquido cefalorraquidiano, bile e sémen, também contêm exossomas.

Os exossomas partilham componentes proteicos comuns envolvidos no transporte e fusão de membranas, incluindo GTPases, anexinas, flotilinas, bem como proteínas transmembrana como CD9, CD63, CD81 e CD82. As proteínas de choque térmico (Hsc70 e Hsp90), proteínas de biogénese de vesículas (Alix e TSG101), proteínas associadas a lípidos e fosfolipases também estão presentes em todos os tipos de exossomas. Atualmente, mais de 4500 proteínas diferentes foram identificadas em exossomas. Além das proteínas, os exossomas contêm uma variedade de lípidos, como colesterol, esfingolípidos e glicerofosfolípidos de cadeia longa.

Além disso, os exossomas contêm uma variedade diversificada de espécies de RNA, incluindo RNA mensageiro (mRNA), microRNA (miRNA)e vários RNAs não codificantes, nomeadamente RNA nuclear pequeno (snRNA), RNA nucleolar pequeno (snoRNA), RNA específico do corpo de Cajal pequeno (scaRNA), RNA interagindo com piwi (piRNA), RNA longo não codificante (lncRNA)e RNA circular (circRNA)A maioria dessas moléculas de RNA identificadas dentro de EVs apresenta comprimentos que variam de 20 a 200 nucleotídeos. Este espectro inclui miARNs e tARNs de comprimento completo, bem como formas fragmentadas de mRNA e rRNA.

Quais são as funções dos exossomas?

Os exossomas, inicialmente percebidos como detritos celulares aquando da sua descoberta, têm atraído uma atenção crescente nos últimos anos devido ao seu papel fundamental na comunicação intercelular. Estas diminutas vesículas envoltas em membrana são agora reconhecidas pelo seu conteúdo de proteínas, lípidos e ácidos nucleicos específicos de células, que funcionam como moléculas sinalizadoras quando transmitidas para células recetoras, influenciando assim as suas funções celulares. Os exossomas desempenham papéis cruciais numa ampla gama de processos fisiológicos e patológicos, incluindo a apresentação de antígenos do sistema imunitário, crescimento e metastização de tumores, regeneração de tecidos após lesão, apoptose celular programada, regeneração vascular, inflamação, coagulação sanguínea, propagação de patógenos, entre outros. Diferentes tipos de células secretam exossomas com composições e funções distintas, tornando-os valiosos como biomarcadores para o diagnóstico de doenças. Devido à sua estrutura de membrana de bicamada lipídica, os exossomas oferecem uma proteção eficaz para o seu conteúdo e podem ser direcionados seletivamente a células ou tecidos específicos, tornando-os uma plataforma promissora para a entrega de medicamentos.

Em meio à crescente ênfase na medicina de precisão, há um foco crescente em alcançar diagnósticos de doenças precisos e tratamentos personalizados. Os exossomas, um campo de investigação emergente e inovador, apresentam uma avenida promissora nesse esforço. A sua ubiquidade no corpo e a facilidade de sua recuperação posicionam-nos como uma abordagem potencialmente eficaz para o diagnóstico e tratamento de doenças. Isso sublinha o seu significativo potencial em avançar o campo da medicina de precisão.

Isolamento de Vesículas Extracelulares

Ultracentrifugação

A ultracentrifugação é um método comum para a isolação de exossomas e pode ser empregue juntamente com a centrifugação em gradiente de densidade de sacarose ou separação por colchão de sacarose para exossomas de baixa abundância. Embora este método seja simples de operar, tem limitações, como a capacidade de processar apenas até seis amostras simultaneamente devido a restrições do rotor, e o rendimento pode ser inconsistente, o que pode estar relacionado ao tipo de rotor utilizado. A ultracentrifugação também requer uma quantidade substancial de material inicial, e o rendimento e a pureza dos exossomas obtidos podem ser questionáveis. Além disso, etapas de centrifugação repetitivas podem potencialmente danificar as vesículas, levando a uma redução na sua qualidade. No entanto, quando a ultracentrifugação é combinada com a centrifugação em gradiente de sacarose, pode resultar em exossomas de alta pureza, embora esta abordagem seja relativamente demorada.

Imunoafinidade com Esferas Magnéticas

Os exossomas possuem marcadores de superfície específicos, como as proteínas CD63 e CD9. Ao incubar exossomas com esferas magnéticas revestidas com anticorpos contra esses marcadores, os exossomas podem ser capturados e isolados. A imunofiltração com esferas magnéticas oferece vantagens, incluindo alta especificidade, facilidade de operação e impacto mínimo na integridade da morfologia dos exossomas. No entanto, apresenta desvantagens, incluindo eficiência reduzida, suscetibilidade da atividade biológica dos exossomas a variações de pH e concentração de sal, o que pode dificultar experimentos subsequentes, e aplicabilidade limitada.

Método de Precipitação Baseado em PEG

O polietileno glicol (PEG) pode ser utilizado para co-precipitar proteínas hidrofóbicas e moléculas lipídicas. Inicialmente utilizado para a coleta de vírus a partir de amostras como soro, agora também é usado para a precipitação de exossomas. O princípio por trás desta técnica pode envolver a ligação competitiva com moléculas de água livres.

No entanto, a utilização de PEG para a precipitação de exossomas apresenta vários desafios. Estes incluem problemas com a pureza e o rendimento, uma presença elevada de impurezas (levando a falsos positivos), tamanhos de partículas não uniformes, a formação de agregados intratáveis que são difíceis de remover, e a potencial destruição de exossomas por forças mecânicas ou aditivos químicos como o Tween-20. Consequentemente, os estudos que utilizam a precipitação com PEG para a isolação de exossomas podem enfrentar escrutínio quando publicados.

Extração Baseada em Reagentes

Nos últimos anos, surgiram no mercado vários kits comerciais de extração de exossomas. Alguns destes kits utilizam filtros especialmente desenhados para remover impurezas, enquanto outros utilizam a Cromatografia de Exclusão por Tamanho (SEC) para separação e purificação. Existem também kits que se baseiam em métodos de precipitação de compostos para precipitar exossomas. Estes kits de reagentes não requerem equipamentos especializados e, à medida que passam por atualizações e melhorias contínuas, a sua eficiência de extração e eficácia de purificação aumentam gradualmente. Consequentemente, estão a substituir gradualmente os métodos de ultracentrifugação e a ganhar uma adoção mais ampla.

Identificação de Exossomas Isolados

Identificação por Microscopia Eletrónica

A abordagem mais direta para identificar exossomas envolve a sua observação sob um microscópio eletrónico. Numa típica análise de microscopia eletrónica de exossomas, estes vesículas aparecem como estruturas esféricas ou em forma de copo, apresentando tamanhos na faixa de 30 a 100 nanómetros.

Identificação por Western Blot

Após a isolação de exossomas, a análise por Western blot (WB) pode ser realizada com proteínas específicas associadas a exossomas. O WB inclui tipicamente proteínas relacionadas à síntese de corpos multivesiculares (MVBs), como Alix e TSG101, bem como proteínas transmembrana tetraspaninas (CD9, CD63, CD81, CD82). Também é aconselhável incluir marcadores não relacionados a exossomas no WB, como GRP94, EEA1, Citocromo c, GM130, PMP70, Calreticulina, e proibição, que estão ausentes nos exossomas e são exclusivos das proteínas totais da célula.

Como Extrair RNA de exossomas

Uma vez que os vesículos extracelulares (EVs) tenham sido isolados, o RNA pode ser extraído diretamente utilizando os seguintes métodos:

Isolar EVs utilizando um kit comercial e, em seguida, extrair RNA utilizando um kit de extração de RNA.

Isolar EVs utilizando um kit comercial e, em seguida, utilizar um kit de extração de RNA compatível, projetado para EVs.

Os nossos experimentos comparativos mostraram que a estratégia 1 produz resultados de extração superiores.

Aplicação de Pesquisa em Exossomas

A imagiologia in vivo confirma a entrega generalizada de exossomas.

No dia 21 de maio de 2015, uma descoberta inovadora no campo da pesquisa sobre a metastização do câncer foi publicada na prestigiada revista "Cell." O estudo foi conduzido por uma equipa de investigadores do Instituto Hubrecht. A sua pesquisa confirmou que as células cancerígenas em processo de metastização podem transmitir comportamentos específicos a células cancerígenas menos malignas. Esta descoberta significativa oferece valiosas perceções sobre o comportamento do câncer e promete melhorar o diagnóstico e tratamento do câncer.

O câncer surge da acumulação de erros genéticos no DNA das células. Alguns desses erros fazem com que as células desconsiderem sinais que controlam o crescimento e a diferenciação, levando a uma divisão celular descontrolada. Isso resulta, em última análise, no crescimento de tumores, com as células tumorais acumulando cada vez mais erros. Devido ao fato de que cada um desses erros de DNA em células tumorais individuais é único (heterogeneidade tumoral), o comportamento dessas células tumorais individuais também pode diferir. Essa complexidade torna o câncer desafiador de tratar, uma vez que combinações específicas de erros de DNA podem tornar algumas células tumorais resistentes ao tratamento.

Para obter uma melhor compreensão do comportamento das células tumorais individuais, os investigadores desenvolveram técnicas de microscopia especializadas, incluindo a microscopia in vivo, para capturar as ações das células cancerígenas dentro de organismos vivos. Atribuíram cores diferentes às células tumorais que apresentavam erros de ADN distintos, utilizando marcadores fluorescentes. Ao imaginar estas células coloridas, tornou-se evidente quais células eram móveis e capazes de iniciar a metastização dentro do corpo.

Células cancerígenas malignas invasivas (azuis) libertam vesículas extracelulares muito pequenas (EVs), como exossomas e microvesículas, contendo moléculas que podem induzir a malignidade celular. Células menos malignas (vermelhas) absorvem estas EVs, alterando o seu comportamento. Células menos malignas tornam-se mais malignas e iniciam a metastização (verdes).

Os cientistas também confirmaram que estes EVs perigosos podem viajar através da corrente sanguínea para outros locais tumorais, replicando comportamentos malignos a longas distâncias.

Os exossomas determinam a especificidade orgânica da metastização tumoral.

O principal contribuinte para as mortes relacionadas com o câncer é a disseminação de células cancerígenas do seu local primário para órgãos remotos através do sistema circulatório. Este processo metastático não é estocástico por natureza. Em vez disso, subconjuntos específicos de células cancerígenas seguem caminhos moleculares intrincados que lhes permitem direcionar-se seletivamente para órgãos particulares e estabelecer colónias dentro deles. Esta migração direcionada envolve uma interação dinâmica entre as células cancerígenas, frequentemente referidas coloquialmente como "sementes", e o microambiente dentro do órgão de destino, comumente conhecido como "solo".

Investigações científicas recentes revelaram um fenómeno intrigante que sugere que, antes da chegada das "sementes" metastáticas, estas têm o potencial de modular o microambiente, frequentemente referido como o "solo", através da utilização de vesículas extracelulares, especificamente, exossomas. Os exossomas são caracterizados de forma sucinta como pequenas vesículas extracelulares com a capacidade de transportar uma variedade de moléculas, incluindo proteínas, lípidos e ácidos nucleicos, entre células. Estas vesículas possuem a capacidade única de navegar pelo sistema circulatório, permitindo-lhes alcançar locais anatómicos distantes. Esta intrincada interação orquestra um diálogo molecular, preparando, em última análise, o terreno para a subsequente metastização tumoral.

Quando exossomas derivados de células cancerígenas são injetados em ratos, estes exossomas tendem a acumular-se nos órgãos onde as células cancerígenas têm tendência a metastizar. Além disso, estes exossomas específicos de órgãos podem interagir com diferentes tipos de células. Por exemplo, exossomas que visam os pulmões aderem a células endoteliais dentro do pulmão, enquanto aqueles que visam o fígado entram nas células imunes de Kupffer. A injeção de exossomas derivados de células cancerígenas na mesma linha celular confirma que os exossomas facilitam a metastização tumoral específica de órgãos.

Os investigadores também fizeram uma descoberta intrigante—exossomas de células de cancro da mama que tipicamente metastatizam para os pulmões podem redirecionar outro tipo de célula tumoral, que normalmente migra para os ossos, para metastatizar para os pulmões. Esta descoberta sublinha ainda mais que as características da metastização das células tumorais não são autónomas, mas são influenciadas por fatores externos.

Os investigadores forneceram várias pistas sobre como os exossomas influenciam a metastização específica de órgãos. Descobriram que os exossomas que visam diferentes órgãos possuem distintas proteínas de receptores de adesão celular, especificamente integrinas na sua superfície. Diferentes tipos de exossomas mostram uma preferência por entrar em órgãos que têm um número substancial de ligandos correspondentes às suas integrinas de superfície. Por exemplo, a integrina αVβ5 direciona os exossomas para o fígado, enquanto a integrina α6β4 os direciona para os pulmões. Além disso, inibir a expressão de exossomas ou integrinas pode inibir a metastização do câncer. Finalmente, quando os exossomas invadem o órgão-alvo, eles desencadeiam a síntese de proteínas S100, promovendo a inflamação e a migração celular, e ativam proteínas Src—tudo isto estabelece as bases para a metastização das células cancerígenas.

Presença de RNA Circular em Exossomas

RNA circular (circRNA) é uma molécula de RNA ubíqua e excecionalmente estável, com uma importância regulatória substancial na expressão genética em mamíferos. Simultaneamente, os exossomas, minúsculas vesículas de membrana derivadas de processos endocíticos, emergiram como um tema de considerável atenção de pesquisa. Numa investigação inovadora recentemente conduzida pela equipa de pesquisa liderada por Shenglin Huang e Xianghuo He no Instituto de Oncologia da Universidade Fudan, uma revelação intrigante veio à tona. Este estudo revelou uma riqueza de circRNAs dentro dos exossomas, um fenómeno anteriormente não reconhecido. As descobertas notáveis deste esforço de pesquisa foram publicadas na revista Cell Research.

A equipa de investigação extraiu RNA total (excluindo RNA ribossómico) a partir de células de cancro do fígado MHCC-LM3 e exossomas derivados dessas células. Eles realizaram análise de RNA-seq e descobriram que as circRNAs nos exossomas são muito mais abundantes do que aquelas nas células de origem.

A: O diagrama de Circos exibe circRNA em células e exossomas derivados de células; D: A razão de circRNA para RNA linear é seis vezes superior em exossomas do que em células. E: Após a transfecção de células HEK293T com miméticos de miR-7, os níveis de CDR1as tanto nas células como nos exossomas derivados de células foram avaliados.

Os investigadores referem-se ao circRNA presente em exossomas como exo-circRNA. O exo-circRNA é mais de duas vezes mais abundante do que o circRNA encontrado nas células de origem. Além disso, o circRNA que entra nos exossomas ultrapassa a quantidade de RNA linear.

Pesquisas anteriores demonstraram a capacidade dos RNAs circulares (circRNAs) de interagir com miRNAs. Dada a abundância de miRNAs dentro de exossomas, os investigadores aprofundaram-se na intrincada relação entre circRNAs e miRNAs. Especificamente, concentraram-se no CDR1as, reconhecido como uma esponja para o miR-7. Para explorar essa relação, miméticos de miR-7 foram transfectados em células HEK293T, e os níveis de CDR1as foram avaliados tanto nas células quanto nos seus exossomas. Notavelmente, o estudo revelou uma redução substancial nos níveis de CDR1as dentro dos exossomas após a transfeção de miR-7, enquanto a diminuição nas células foi marginal. Esta descoberta implica que o empacotamento de circRNAs em exossomas é um processo regulado, influenciado, pelo menos em parte, pela modulação dos níveis de miRNA relevantes dentro das células de origem.

Além dos exossomas derivados de células, os investigadores também descobriram uma quantidade significativa de circRNA intacto e estável em exossomas do soro humano. Além disso, o circRNA nos exossomas do soro de pacientes com câncer colorretal apresentou diferenças notáveis em comparação com aqueles de indivíduos saudáveis. O exo-circRNA originado de tumores apresenta potencial como um biomarcador para a deteção de câncer.

Sequenciação do Transcriptoma de Exossomas

Os exossomas contêm principalmente RNA, incluindo RNA não codificante.pequeno RNA, lncRNA, circRNA) e RNA codificante (mRNA). Eles desempenham um papel crucial na comunicação intercelular e na regulação da expressão génica. Dadas as suas vantagens, como a amplificabilidade e a alta representação, o RNA em exossomas ocupa uma posição dominante na investigação do conteúdo dos exossomas e na exploração funcional. Além disso, o RNA pequeno consiste em vários tipos de pequenos RNAsincluindo miARNpiRNA, tsRNA, YRNA, cada uma com funções distintas.

As distinções são evidentes entre RNA exossomal e RNA extraído de amostras de tecido padrão, levando a investigações sobre a composição do RNA exossomal. A CD Genomics desenvolveu um fluxo de trabalho abrangente que se baseia em amostras autênticas, abrangendo a isolação de exossomas, a extração de RNA exossomal, a construção de bibliotecas de transcriptoma, o estabelecimento de bibliotecas de miRNA e a análise subsequente dos dados adquiridos.

Referências:

1. A imagem in vivo revela a fenocopia mediada por vesículas extracelulares do comportamento metastático. Célula. 2015.
2. Câncer: Vesículas que procuram órgãos. Natureza. 2015.
3. O RNA circular está enriquecido e é estável em exossomas: um biomarcador promissor para o diagnóstico do câncer. Células Res. 2015.