ChIP-seq vs. ATAC-seq

As regiões regulatórias da cromatina desempenham papéis fundamentais em numerosos processos patológicos e no desenvolvimento embrionário. Para desvendar a paisagem regulatória genómica de células e tecidos, tecnologias de sequenciação epigenómica de ponta como Sequenciação por Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP-seq) e a Sequenciação de Alta Vazão de Cromatina Acessível a Transposase (ATAC-seq) emergiram. Estas técnicas permitem-nos explorar estados específicos da cromatina e os seus fatores de transcrição associados, proporcionando informações valiosas sobre as dimensões temporais e espaciais da regulação genética.

A chegada da tecnologia de Imunoprecipitação de Cromatina em Chip (ChIP-chip) expandiu ainda mais o repertório de métodos de análise epigenómica. Técnicas notáveis incluem ChIP-seq, Sequenciação de Locais Ultrasensíveis de DNase I (DNase-seq) e ATAC-seqEstas abordagens poderosas permitem que os investigadores analisem de forma abrangente as interações dinâmicas entre o DNA e as proteínas, lançando luz sobre as complexas redes regulatórias que governam os processos celulares e influenciam os resultados das doenças.

Métodos baseados em ChIP

Os avanços nos métodos de pesquisa baseados em ChIP trouxeram uma abordagem mais poderosa e refinada em comparação com microarrays. O ChIP-seq oferece várias vantagens-chave, incluindo alta resolução, ruído reduzido e ampla cobertura. À medida que o custo do sequenciamento de segunda geração continua a diminuir rapidamente, o ChIP-seq está prestes a se tornar uma ferramenta indispensável no estudo da regulação gênica e da epigenética.

Em contraste com microarrays, o ChIP-seq fornece uma visão abrangente e detalhada das interações entre DNA e proteínas, permitindo que os investigadores caracterizem melhor os motivos de sequência e identifiquem fatores de transcrição críticos, potenciadores e outros elementos reguladores. Esta precisão e sensibilidade aprimoradas tornam o ChIP-seq um ativo inestimável na desvendar das complexidades da regulação genómica e na elucidação dos mecanismos subjacentes a vários processos biológicos.

Por favor, consulte o nosso artigo. ChIP-Seq: Uma Ferramenta Versátil para a Epigenómica.

Métodos para análise de ChIP-seq. (Nakato et al., 2021)

ChIP-Seq Tradicional

A técnica tradicional de ChIP-seq, um pilar na pesquisa genómica, tem como objetivo capturar o DNA ligado a proteínas específicas. Este processo em múltiplas etapas envolve a ligação cruzada do DNA e das proteínas in situ utilizando formaldeído, seguido de sonicação para criar pequenos fragmentos de DNA de 200-600 pares de bases. A imunoprecipitação com anticorpos específicos é então realizada para isolar complexos de DNA-proteína, que são posteriormente desconectados. O DNA libertado passa por etapas de preparação de biblioteca, como reparação de extremidades, ligação de junções e sequenciação.

No entanto, o ChIP-seq tem certas limitações. O viés da reação em cadeia da polimerase (PCR) e o comprimento de amplificação limitado podem introduzir artefatos. O viés de GC durante a lise e a sequenciação pode afetar a qualidade dos dados. Além disso, a necessidade de um número considerável de células (10⁵ ∼10⁷ As células) podem resultar em perdas substanciais durante o processo de imunoprecipitação. Além disso, o processo de entrelaçamento com formaldeído pode mascarar os epítopos antigénicos de fatores de transcrição, levando a potenciais resultados falso-positivos. Uma abordagem alternativa, conhecida como ChIP natural (N-ChIP), elimina o problema do mascaramento de epítopos e pode ser utilizada quando se lida com um número muito pequeno de células.

Tecnologia ChIP para Microcélulas

Para superar a limitação de exigir um grande número de células, os investigadores exploraram a tecnologia ChIP para microcélulas. Vários métodos foram desenvolvidos para otimizar experiências com baixo número de células. Técnicas como blotting químico em combinação com imunoprecipitação de cromatina e transposase Tn5 para preparação de bibliotecas de sequenciamento permitiram ChIP-seq de histonas utilizando apenas 10.000 células. O MNase de ultra-baixo input baseado em ChIP natural (ULI-NChIP) gerou perfis de modificação de histonas de alta qualidade a partir de 10^3 a 10^6 células-tronco embrionárias, graças a adaptações no protocolo NChIP. Outra abordagem inovadora, o ChIP-seq baseado em lavagem oscilatória microfluídica (MOWChIP-seq), permite até a análise em todo o genoma de modificações de histonas utilizando apenas 100 células. Embora esses métodos possam fornecer perfis de modificação de histonas relativamente precisos em poucas células, a sua eficácia é limitada para muitos fatores de transcrição devido à escassez de locais de ligação no genoma.

ChIP-seq em célula única (scChIP-seq)

Entre no reino do ChIP-seq de célula única (scChIP-seq), que oferece uma perspetiva inovadora. Ao contrário do ChIP-seq em massa, que captura características da cromatina de uma população de células, o scChIP-seq permite que os investigadores estudem a diversidade genética dentro de populações celulares heterogéneas e compreendam a dinâmica evolutiva das populações tumorais. O ChIP-seq de célula única em gotículas (Drop-ChIP) integra um dispositivo microfluídico com DNA de célula única, permitindo a geração de mapas de cobertura relativamente baixa por célula.

Leitura Recomendada: As Vantagens e o Fluxo de Trabalho do ChIP-seq.

ATAC-Seq

A tecnologia ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin sequencing) revolucionou os ensaios de cromatina acessível por transposase, permitindo que os investigadores identifiquem simultaneamente regiões de cromatina aberta, a localização de nucleossomas e motivos regulatórios com requisitos de amostra reduzidos (tão baixos quanto 500~5000 células). Ao utilizar a inferência de motivos, os cientistas deduziram com sucesso os locais de ligação de proteínas ligadoras de DNA em linhas celulares B usando ATAC-seq.

Leitura Recomendada: ATAC-Seq – Um Método para Estudar a Cromatina Aberta.

Análise de sequenciação ATAC de célula única. (Baek et al., 2020)

Uma das principais vantagens do ATAC-seq é o seu procedimento de preparação de biblioteca "em duas etapas" relativamente simples e eficiente: transposição e PCR. Em experimentos de ATAC-seq, os núcleos são isolados e coletados, e a cromatina dentro do núcleo é fragmentada utilizando a transposase Tn5, que depois liga os junções de sequenciação, simplificando significativamente o processo experimental. O DNA da cromatina compactada não consegue entrar no transposoma, enquanto o DNA da cromatina em regiões abertas é inserido aleatoriamente e fragmentado pelo transposoma. O DNA fragmentado resultante é coletado para análise subsequente.

A inovação mais notável do ATAC-seq reside na utilização da transposase Tn5. Inicialmente, a transposase Tn5 apresenta baixa atividade de transposição, mas através de modificações direcionadas, pode ser convertida em uma forma altamente ativa com maior afinidade pelo DNA, tornando-a mais adequada para a pesquisa científica. Ao montar a transposase Tn5 in vitro com articuladores projetados, os investigadores podem formar complexos de transposoma ativos, aumentando a eficiência e a precisão do ensaio.

No entanto, é crucial reconhecer que a transposase Tn5 introduz viés devido à ligação dependente da sequência. No entanto, foram desenvolvidas ferramentas computacionais para corrigir esse viés de transposição, garantindo a precisão e a fiabilidade dos dados de ATAC-seq.

Combinação de ChIP-seq e ATAC-seq

Ao comparar múltiplas amostras, confiar apenas em ChIP-seq pode apresentar desafios na identificação de elementos regulatórios significativos. Nesses casos, o ATAC-seq surge como um complemento valioso devido à sua alta resolução e relação sinal-ruído, permitindo a identificação de sequências reguladas de forma diferencial, incluindo potenciadores. A integração do ChIP-seq com o ATAC-seq simplifica a identificação de picos distintos, aumentando o poder analítico.

Embora técnicas como DNase-seq e ATAC-seq possam inferir características genómicas, não podem substituir totalmente a informação fornecida pelo ChIP-seq. Todos esses métodos detectam indiretamente os locais de ligação entre fatores de transcrição e DNA, necessitando de uma validação adicional dos locais de ação dos fatores de transcrição inferidos com base em motivos enriquecidos.

ChIP-seq identifica diretamente interações específicas entre DNA e proteínas, enquanto ATAC-seq revela a abertura do cromatina em todo o genoma, proporcionando uma perspetiva única sobre a paisagem regulatória da cromatina. Ao empregar tanto ATAC-seq como ChIP-seq em combinação, os investigadores podem alcançar uma compreensão mais abrangente e profunda das dinâmicas da regulação da cromatina e das suas implicações biológicas.

No entanto, existem limitações potenciais ao usar o ATAC-seq isoladamente:

• Nem todos os reguladores da cromatina possuem motivos correspondentes; por exemplo, as proteínas de remodelação da cromatina não têm sequências de ADN específicas. As interações entre estas proteínas e os nucleossomas são críticas para o desenvolvimento embrionário inicial e as decisões sobre o destino celular, e a sua ligação não pode ser inferida apenas a partir da informação da cromatina aberta.
• Certos motivos podem ser ligados por múltiplos fatores de transcrição específicos de sequência, levando a ambiguidade na identificação de fatores de transcrição.
• Alguns fatores de transcrição homólogos partilham padrões de motivos semelhantes, tornando difícil atribuir diretamente a cromatina aberta a um fator de transcrição individual específico. Nesses casos, a deteção direta de interações entre fatores de transcrição específicos e DNA continua a ser mais fiável.

Em resumo, a utilização combinada de ChIP-seq e ATAC-seq oferece uma abordagem poderosa para obter uma compreensão mais profunda do panorama regulatório da cromatina. Enquanto o ATAC-seq complementa o ChIP-seq ao fornecer uma perspetiva mais ampla sobre a abertura da cromatina, o ChIP-seq assegura a identificação direta de interações específicas entre DNA e proteínas. Esta integração tem o potencial de revelar dinâmicas intrincadas de regulação genética e desvendar a importância funcional das modificações da cromatina em vários contextos biológicos.

Referências:

1. Nakato, Ryuichiro, e Toyonori Sakata. "Métodos para análise de ChIP-seq: Um fluxo de trabalho prático e aplicações avançadas." Métodos 187 (2021): 44-53.
2. Baek, Seungbyn, e Insuk Lee. "Análise de sequenciação ATAC de célula única: Da pré-processamento de dados à geração de hipóteses." Revista de Biotecnologia Computacional e Estrutural 18 (2020): 1429-1439.