Diretrizes para Submissão de Amostras
As Vantagens e o Fluxo de Trabalho do ChIP-seq
O que é ChIP-seq?
ChIP-sequenciação (também conhecido como ChIP-seq), que combina ensaios de imunoprecipitação de cromatina (ChIP) com Sequenciação de DNAé uma técnica poderosa para a perfuração do genoma de proteínas que se ligam ao DNA, modificações de histonas ou nucleossomas. ChIP é um tipo de método experimental de imunoprecipitação (IP) utilizado para isolar locais específicos de DNA em interação física direta com fatores de transcrição e outras proteínas. No ChIP, anticorpos específicos são utilizados para enriquecer fragmentos de DNA ligados a proteínas ou nucleossomas particulares.
ChIP-seq foi uma das primeiras aplicações de NGS (sequenciação de nova geração), e o primeiro estudo de perfilagem em larga escala das metilações de histonas em todo o genoma utilizando ChIP-seq foi publicado em 2007 (Barski et al., 2007). O sequenciamento deste estudo foi realizado na plataforma do analisador de genoma Solexa 1G. No mesmo ano, Johnson et al. (2007) utilizaram ChIP-seq para gerar o mapeamento em todo o genoma dos locais de ligação de fatores de transcrição. Robertson et al. (2007) desenvolveram ChIP-seq identificar sequências de ADN de mamíferos ligadas a fatores de transcrição in vivo. Estes dois artigos também demonstraram a maior sensibilidade e especificidade de ChIP-seqDevido ao rápido progresso de tecnologia NGS e o custo decrescente da sequenciação, ChIP-seq tornou-se uma ferramenta indispensável para a caracterização de epigenomas e o estudo da regulação gênica (Park, 2009).
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Diferença entre ChIp-chip e ChIp-seq
ChIP-chip, ChIP acoplado a microarrays, e ChIP-seq são duas técnicas padrão para a identificação das interações de ligação entre o DNA e as proteínas em todo o genoma. Aproveitando as tecnologias de sequenciação, ChIP-seq oferece muitas vantagens em relação ao ChIP-chip, conforme resumido na Tabela 1 (Park, 2009; Schones e Zhao, 2008).
Tabela 1. Comparação entre ChIP-chip e ChIP-seq.
| ChIP-chip | ChIP-seq | |
| Resolução máxima | Específico de array, geralmente 30-100 pb | Nucleótido único |
| Cobertura | Limitado por sequências no array; regiões repetitivas são geralmente mascaradas. | Limitado apenas pela alinhabilidade das leituras ao genoma; aumenta com o comprimento da leitura; muitas regiões repetitivas podem ser cobertas. |
| Flexibilidade | Dependente dos produtos disponíveis; múltiplos arrays podem ser necessários para genomas grandes. | Ensaios genómicos em qualquer organismo sequenciado |
| Fonte de ruído da plataforma | Hibridização cruzada entre sondas e alvos não específicos | Pode haver algum viés de GC presente. |
| Desenho experimental | Canal único ou duplo, dependendo da plataforma | Canal único |
| Casos rentáveis | Perfilagem de regiões selecionadas; quando uma grande fração do genoma está enriquecida para a modificação ou proteína de interesse (ligação ampla) | Genomas grandes; quando uma pequena fração do genoma está enriquecida para a modificação ou proteína de interesse (ligação aguda) |
| Quantidade necessária de DNA ChIP | Alto (alguns microgramas) | Baixo (10-50 ng) |
| Gama dinâmica | Limite de deteção inferior; saturação em sinal elevado | Não limitado |
| Amplificação | Mais necessário | Menos necessário; sequenciação de moléculas únicas sem amplificação está disponível. |
| Multiplexação | Não é possível. | Possível |
Como funciona o ChIP-seq
O fluxo de trabalho de ChIP-seq usado para perfilar os locais específicos de ligação ao DNA para fatores de transcrição, enzimas ligadoras de DNA ou outras proteínas associadas ao DNA (ChIP não-histona) e os locais de DNA correspondem a nucleossomas modificados (ChIP de histona) é ilustrado na Figura 1 (Park, 2009). Seguindo os protocolos de ChIP, a cromatina é fragmentada e as proteínas cruzadas ou nucleossomas modificados são imunoprecipitados usando um anticorpo específico para a proteína ou a modificação da histona. Após a purificação do DNA e a construção da biblioteca, os fragmentos de DNA podem ser sequenciados simultaneamente em qualquer uma das plataformas de sequenciamento, como o Analisador de Genoma Illumina Solexa, Roche 454 e plataformas SOLiD da Applied Biosystems (ABI), e HeliScope da Helicos, como ilustrado na Figura 1. Com o tremendo progresso de tecnologia NGSA plataforma Illumina, como o Hiseq, tem sido a plataforma mais amplamente utilizada para sequenciação.
Figura 1. Visão geral de um experimento ChIP-seq (Park, 2009).
Design Experimental de ChIP-seq
A Enciclopédia de Elementos de DNA (ENCODE) e os consórcios de organismos modelo ENCODE (modENCODE) desenvolveram um conjunto de normas e diretrizes de trabalho para ChIP-seq experiências baseadas na experiência de centenas de ChIP-seq experimentos (Landt et al., 2012). Para obter dados de ChIP-seq de alta qualidade, há vários aspectos técnicos que devem ser considerados na ChIP-seq design experimental, incluindo anticorpos, número de células, controlos, réplicas, fragmentação de cromatina, construção de bibliotecas e sequenciação (Kidder et al., 2011).
Anticorpos
A qualidade dos anticorpos utilizados para ChIP é um dos fatores mais importantes que contribuem para a qualidade de ChIP-seq dados.
Um anticorpo sensível e específico proporcionará um alto nível de enriquecimento. A eficiência limitada do anticorpo é a principal razão para o fracasso. ChIP-seq experimentos.
A validação e caracterização de anticorpos devem ser feitas antes do início da ChIP.
Número de telemóvel
Como a relação sinal-ruído (SNR) está diretamente correlacionada com o número de células, usar o número correto de células pode ajudar a diminuir o ruído de fundo.
A abundância da proteína ou modificação de histona a ser investigada e a qualidade do anticorpo devem ser consideradas ao determinar o número de células.
Controles
Uma parte importante de ChIP-seq o desenho experimental é determinar quais controles utilizar. A ChIP-seq o pico deve ser comparado com a mesma região num controlo pareado.
Existem vários tipos de controlo diferentes, mas não há consenso sobre qual é o mais apropriado:
Entrada de DNA.
IP simulado: DNA obtido de IP sem anticorpo.
IP não específico: usando um anticorpo contra uma proteína que não é conhecida por estar envolvida na ligação ao DNA.
Replicados
Alta qualidade ChIP-seq Os conjuntos de dados são recursos valiosos para a comunidade. Muitos fatores, incluindo condições de cultura celular, ChIP e construção de bibliotecas, podem contribuir para a variabilidade entre os conjuntos de dados.
Para garantir a fiabilidade dos dados, são necessários experimentos de replicação biológica.
Fragmentação da cromatina
Antes da ChIP, a cromatina deve ser fragmentada em um tamanho manejável.
ChIP-seq para proteínas que se ligam ao DNA, utiliza-se digestão com endonucleases ou sonicação para fragmentar o DNA.
ChIP-seq para modificações de histonas utiliza a digestão com nuclease micrococcal (MNase) para fragmentar o DNA.
Construção de biblioteca e sequenciação
As bibliotecas podem ser construídas a partir de DNA de ChIP por protocolos padrão específicos para a plataforma de sequenciamento.
O processo na construção da biblioteca e sequenciação, incluindo seleção de tamanho, purificação em gel, PCR, estratégia de sequenciação de extremidade única ou extremidade pareada e profundidade de sequenciação, afetaria o ChIP-seq qualidade de dados.
Considerando os aspectos técnicos acima, um ChIP-seq um sequenciador de próxima geração. O design experimental que obteria dados de alta qualidade é ilustrado na Figura 2 (Kidder et al., 2011). Primeiro, os controlos apropriados para a especificidade do anticorpo devem ser determinados antes do ChIP. A cromatina é fragmentada para um intervalo de tamanho ideal por sonicação ou meios enzimáticos após a isolação do número ideal de células. Em seguida, anticorpos de alta qualidade são utilizados para o ChIP. Após a purificação do DNA enriquecido por ChIP, uma biblioteca é construída para permitir sequenciação em NGS plataformas.
Figura 2. Design experimental de ChIP-seq (Kidder et al., 2011).
Na CD Genomics, fornecemos-lhe sequenciação de alta qualidade e integrada. bioinformática análise para o seu ChIP-Seq projeto, permitindo rastrear com precisão e determinar os locais de ligação de proteínas em todo o genoma. Se tiver requisitos adicionais ou perguntas, não hesite em contactar-nos.
Leitura adicional:
Pipeline e Ferramentas para Análise de ChIP-seq
Referências:
- Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T.Y., Schones, D.E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., e Zhao, K. (2007). Perfilagem de alta resolução das metilações de histonas no genoma humano. Célula 129, 823-837.
- Johnson, D.S., Mortazavi, A., Myers, R.M., e Wold, B. (2007). Mapeamento do genoma inteiro das interações proteína-DNA in vivo. Ciência 316, 1497-1502.
- Kidder, B.L., Hu, G., e Zhao, K. (2011). ChIP-Seq: considerações técnicas para a obtenção de dados de alta qualidade. Imunologia da Natureza 12, 918-922.
- Landt, S.G., Marinov, G.K., Kundaje, A., Kheradpour, P., Pauli, F., Batzoglou, S., Bernstein, B.E., Bickel, P., Brown, J.B., Cayting, P., et al. (2012). Diretrizes e práticas de ChIP-seq dos consórcios ENCODE e modENCODE. Pesquisa genómica 22, 1813-1831.
- Park, P.J. (2009). ChIP-seq: vantagens e desafios de uma tecnologia em maturação. Nature Reviews Genetics 10, 669-680.
- Robertson, G., Hirst, M., Bainbridge, M., Bilenky, M., Zhao, Y., Zeng, T., Euskirchen, G., Bernier, B., Varhol, R., Delaney, A., et al. (2007). Perfis genómicos de associação do DNA da STAT1 utilizando imunoprecipitação de cromatina e sequenciação massivamente paralela. Métodos da Natureza 4, 651-657.
- Schones, D.E., e Zhao, K. (2008). Abordagens em todo o genoma para estudar modificações da cromatina. Nature Reviews Genetics 9, 179-191.
