Pipeline e Ferramentas para Análise de ChIP-Seq

O que é a análise Chip-Seq?

Sequenciação por Imunoprecipitação de CromatinaChIP-seqA análise serve como uma técnica indispensável na pesquisa epigenómica. Este método utiliza anticorpos que visam proteínas de ligação ao DNA específicas ou modificações de histonas para identificar regiões de enriquecimento dentro do genoma. A utilização de modificações de histonas na análise de ChIP-seq permite uma dissecção profunda das características epigenéticas e das suas funcionalidades biológicas. Com os avanços em Sequenciação de Próxima Geração As tecnologias de sequenciação de nova geração (NGS) e as análises computacionais, a nossa compreensão da paisagem epigenómica cresceu substancialmente, informando-nos sobre como pode contribuir para a identidade celular, desenvolvimento, especificação de linhagens e a etiologia de um amplo espectro de condições, incluindo o câncer e outras doenças.

Vantagens do ChIP-Seq 

• O ChIP-seq a tecnologia possui a capacidade de delinear ao nível dos nucleótidos, oferecendo informações sobre locais de ligação da cromatina com um detalhe exquisito em genomas inteiros, lançando assim luz sobre as complexidades das interações proteína-DNA. Isso permite-nos identificar com maior precisão os locais de ligação das proteínas, como os dos fatores de transcrição e das enzimas de modificação de histonas.
• Ao contrário do ChIP-chip, não há ruído gerado pela hibridização de fragmentos de DNA, onde o conteúdo de GC, o comprimento do fragmento, a concentração e as variações estruturais podem interferir na hibridização.
• ChIP-seq permite a análise em todo o genoma, estendendo-se além da análise da área local. Este âmbito mais amplo permite uma compreensão abrangente dos padrões de ligação de uma determinada proteína a nível genómico, abrangendo a identificação e regulação de genes-alvo.
• Os sinais de ligação de cromatina quantitativos oferecidos pelos dados de ChIP-seq refletem a abundância e a intensidade de ligação de proteínas em diferentes regiões genómicas. Esta análise quantitativa facilita a comparação dos padrões de ligação de cromatina sob condições variadas e permite a identificação de locais de ligação diferencial.
• A característica de sequenciação de alto rendimento de ChIP-seq permite o processamento simultâneo de um grande número de amostras e dados, melhorando a eficiência experimental. Além disso, a sua alta sensibilidade permite a deteção de locais de ligação de proteínas em baixa abundância, revelando potenciais regiões regulatórias críticas.
• A tecnologia ChIP-seq, independentemente de suposições anteriores ou do design de primers, apresenta um viés experimental mínimo e erro sistemático, resultando em dados mais objetivos e fiáveis.
• ChIP-seq os dados também podem ser integrados com outros dados ómicos (como RNA-seq, ATAC-seq, etc.) para uma análise abrangente que permita compreender plenamente as complexidades das redes regulatórias de expressão génica. Esta análise integrativa contribui para elucidar as interacções multilayer entre a estrutura da cromatina e a regulação génica.

Os Desafios do Chip-Seq

ChIP-seq é um método poderoso para identificar locais de ligação ao DNA em todo o genoma para uma proteína de interesse. Mapear as localizações cromossómicas de fatores de transcrição (TFs), nucleossomas, modificações de histonas, enzimas de remodelação da cromatina, chaperonas e polimerases é uma das tarefas-chave da biologia moderna. Para tal, o ChIP-seq é a metodologia padrão (Bailey et al., 2013). Vários desafios apresentados no ChIP-seq não estão apenas na preparação de amostras e sequenciação, mas também na análise computacional.

Ao contrário de outros tipos de dados de sequenciação massivamente paralela, o ChIP-seq os dados têm várias características:

• As modificações de histonas cobrem regiões mais amplas de DNA do que os fatores de transcrição.
• As leituras são cortadas para um número menor de bases.
• Os fragmentos são bastante grandes em relação aos locais de ligação dos fatores de transcrição (TFs).
• As medições da modificação de histonas muitas vezes ondulam seguindo nucleossomas bem posicionados.

Para extrair dados significativos das leituras de sequência bruta, o ChIP-seq a análise de dados deve:

• Identificar regiões genómicas - 'picos' - onde os fatores de transcrição se ligam ou as histonas são modificadas.
• Quantificar e comparar níveis de ligação ou modificação de histonas entre amostras.
• Caracterize as relações entre o estado da cromatina e a expressão génica ou o splicing.

Fluxo de Trabalho de Análise Bioinformática de Chip-Seq

O fluxo de trabalho de análise bioinformática para dados de ChIP-seq e as considerações para cada etapa estão ilustrados na Figura 1 (Nakato e Shirahige, 2017). O procedimento de preparação de amostras, sequenciação e mapeamento (Figura 1A) é comum tanto em experimentos com uma ou poucas amostras (Figura 1B) quanto em experimentos com muitas amostras (Figura 1C). Inicialmente, as leituras de sequenciação de ChIP-seq são analisados para avaliar a qualidade das leituras. Após as métricas de qualidade, as leituras são mapeadas para o genoma de referência. Comparados com as leituras de entrada, as regiões genómicas que estão significativamente enriquecidas para leituras de ChIP são detectadas como picos. Outras regiões genómicas são consideradas como fundo não específico. As densidades de leitura podem ser visualizadas ao longo do genoma. É possível ajustar a estratégia de chamada de picos e os parâmetros às propriedades de cada amostra na análise em escala de amostra (Figura 1B). Mas o ajuste um a um é difícil para a análise em grande escala (Figura 1C), na qual métricas de qualidade objetivas para uma avaliação quantitativa multilateral são necessárias para filtrar automaticamente dados de baixa qualidade. Os picos chamados representam candidatos de modificação de histonas e locais de ligação de proteínas ou DNA-alvo, que podem ser usados para identificar anotações funcionais associadas, como motivos de ligação.

Figura 1. Fluxo de trabalho da análise ChIP-seq. Adaptado de (Nakato e Shirahige, 2017)

Ao conduzir ChIP-Seq Na análise de dados de Sequenciação por Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP-Seq), os processos geralmente observados são: tratamento de dados brutos, análise de controlo de qualidade, mapeamento de leituras, avaliação da qualidade de alinhamento das leituras, chamada de picos, anotação e análise, entre outros passos primários.

Controlo de Qualidade: O objetivo da etapa de Controlo de Qualidade (CQ) é avaliar a qualidade substantiva dos dados de alto rendimento produzidos a partir da sequenciação. Isso inclui inspecionar a qualidade dos dados brutos de sequenciação, como a distribuição do comprimento das leituras de sequenciação e a taxa de erro de sequenciação. A ferramenta mais frequentemente utilizada para tal análise é o FastQC. Além disso, caso sejam identificadas sequências de baixa qualidade, estas podem ser descartadas nas fases de aparo subsequentes.

Leitura de Mapeamento: O objetivo do mapeamento de leituras é alinhar as leituras de sequenciamento cortadas com o genoma de referência. Isso visa determinar a posição genómica precisa de cada leitura. Ferramentas de mapeamento como Bowtie, Bowtie2 ou BWA são tipicamente utilizadas para o mapeamento de leituras de sequenciamento, com entradas nos formatos FASTQ ou CSFSATQ. Tanto o Bowtie2 como o BWA levam em consideração indels (inserções e deleções) através do alinhamento de lacunas, tornando-os adequados para leituras longas e/ou de extremidade emparelhada.

Chamada de Pico: O passo de identificação de picos concentra-se em reconhecer as áreas de rica interação proteína-DNA ao longo do genoma. O MACS2 é uma ferramenta comumente utilizada na análise de dados de ChIP-Seq, altamente funcional na distinção de áreas aumentadas dentro de ChIP-Seq dados, devido à sua incorporação de informações genómicas e modelos estatísticos. No entanto, o recente desenvolvimento de várias ferramentas de identificação de picos acrescenta ao repertório de métodos disponíveis. Por exemplo, o SICER é outra aplicação projetada para identificar regiões enriquecidas em ChIP-Seq dados. Ao considerar não apenas a proeminência dos picos, mas também o seu padrão de distribuição espacial, o SICER pode oferecer resultados mais aceitáveis em comparação com o MACS2 em certas circunstâncias. Certos artigos sugeriram que a utilização de bibliotecas de DNA de entrada distintas como controles de fundo pode impactar significativamente a deteção de picos. Geralmente, ao empregar uma biblioteca INPUT-seq com maior profundidade de sequenciação para normalização, um maior número de picos é identificado como estatisticamente significativo, apesar das variações na magnitude das disparidades entre diferentes conjuntos de dados de ChIP. 

Figura 2. Efeito da normalização com diferentes INPUT-seq na chamada de picos de ChIP-seq. (Ho et al., 2011)

Anotação de Pico: A anotação funcional das regiões enriquecidas identificadas é realizada, incluindo a classificação funcional dos genes-alvo, elementos regulatórios, etc. As ferramentas predominantemente utilizadas para este fim incluem ChIPseeker e Homer.

Análise Diferencial: Diferentes condições de ChIP-Seq os dados são comparados para identificar diferenças em regiões enriquecidas, a fim de identificar genes-alvo de fatores de transcrição ou alterações na estrutura da cromatina. As principais ferramentas utilizadas incluem DESeq2, edgeR, entre outras.

Análise de Enriquecimento de Conjuntos de Genes: Ferramentas como GOseq e ChIP-Enrich são utilizadas para analisar a associação entre regiões enriquecidas e conjuntos de genes específicos para anotação funcional e interpretação biológica.

Interpretação e Visualização de Resultados: A interpretação biológica dos resultados da análise diferencial e das regiões enriquecidas é realizada, verificando a consistência com as hipóteses de pesquisa. Por fim, utilizando ferramentas como o IGV (Integrative Genomics Viewer), pacotes R (ggplot2, heatmap, etc.), os resultados de ChIP-Seq os dados são visualizados, mostrando regiões enriquecidas, anotação de genes e resultados de análise diferencial.

Ferramentas de Análise de Dados Chip-Seq

Tem havido um grande esforço para melhorar as ferramentas analíticas que são utilizadas na análise de ChIP-seq dados, e cada passo levou ao desenvolvimento de ferramentas de software especializadas. Um subconjunto de ferramentas de software disponíveis para mapeamento e chamada de picos está brevemente listado na Tabela 1 (Furey, 2012).

Tabela 1. Um subconjunto de ferramentas de software disponíveis para mapeamento e chamada de picos na análise de dados de ChIP-seq.

Além da deteção de regiões enriquecidas ou ligadas em ChIP-seq análise de dados, uma questão importante é determinar as diferenças entre condições. Devido à complexidade dos dados de ChIP-seq em termos de ruído e variabilidade, a questão é particularmente desafiadora para o ChIP-seq. Muitas ferramentas computacionais diferentes foram desenvolvidas e publicadas nos últimos anos para análise diferencial. ChIP-seq análise. Estas ferramentas mostram diferenças importantes nas suas configurações algorítmicas, no número e tamanho das regiões diferenciais detectadas (DR), e no alcance de aplicabilidade. A descrição de 14 ferramentas diferentes para a análise de dados de ChIP-seq diferencial está listada na Tabela 2 (Steinhauser et al., 2016).

Tabela 2. Descrição de diferentes ferramentas para análise de dados ChIP-seq diferenciais.

A árvore de decisão que indica a escolha adequada da ferramenta está ilustrada na Figura 3. A escolha da ferramenta depende de vários fatores: forma do sinal (picos acentuados ou ampliações amplas de ChIP), presença de réplicas e presença de um conjunto externo de regiões de interesse. As ferramentas indicadas em preto apresentam bons resultados usando as configurações padrão, enquanto as ferramentas em cinza exigiriam um ajuste mais extenso dos parâmetros para alcançar resultados ótimos.

Figura 3. Árvore de decisão indicando a escolha adequada da ferramenta. Adaptado de (Steinhauser et al., 2016).

Diretrizes Técnicas para Análise de Dados Chip-Seq

Avanços recentes em tecnologias de sequenciação e análises permitem-nos lidar com centenas de amostras de ChIP simultaneamente. Mas ainda existem algumas questões na análise de ChIP-seq dados, como os picos de falsos positivos, as leituras mapeadas múltiplas e a fraca sobreposição entre os resultados dos algoritmos de deteção de picos. Para obter resultados de alta qualidade da análise computacional de ChIP-seq dados, alguns aspectos técnicos devem ser considerados, os quais foram listados abaixo (Bailey et al., 2013):

1) Profundidade de Sequenciamento

Análise eficaz de ChIP-seq os dados requerem uma cobertura suficiente por leituras de sequência (profundidade de sequenciamento). A profundidade de sequenciamento necessária depende principalmente do tamanho do genoma e do número e tamanho dos locais de ligação da proteína.

20 milhões de leituras podem ser adequadas para TFs mamíferos e modificações da cromatina, que estão tipicamente localizadas em locais específicos e estreitos, como marcas de histonas associadas a potenciadores (Landt et al., 2012).

As proteínas com fatores mais amplos, incluindo a maioria das marcas de histonas, ou mais locais de ligação, como a RNA Pol II, requererão até 60 milhões de leituras para mamíferos. ChIP-seq (Chen et al., 2012).

As amostras de controlo devem ser sequenciadas de forma significativamente mais profunda do que as amostras de ChIP.

2) Ler Mapeamento e Métricas de Qualidade

Antes de mapear para o genoma de referência, as leituras devem ser filtradas aplicando um limite de qualidade.

É importante considerar a percentagem de leituras mapeadas de forma única reportadas pelas ferramentas de mapeamento.

3) Chamada de Picos

A análise de dados de ChIP-seq consiste em prever as regiões do genoma onde a proteína ChIPada está ligada, identificando regiões com picos.

Um equilíbrio adequado entre sensibilidade e especificidade depende da escolha de um algoritmo de deteção de picos e de um método de normalização apropriados, com base no tipo de proteína ChIPada.

4) Avaliação da Reprodutibilidade

Para garantir a reprodutibilidade dos resultados experimentais, devem ser realizados pelo menos dois replicados biológicos de cada. ChIP-seq recomenda-se que os experimentos sejam realizados.

A reprodutibilidade tanto das leituras como dos picos identificados deve ser examinada.

5) Análise de Ligação Diferencial

Comparativo ChIP-seq A análise de um número crescente de regiões ligadas a proteínas em diferentes condições ou tecidos é esperada com o aumento constante de projetos de NGS (sequenciação de nova geração).

O cálculo direto de regiões diferencialmente ligadas entre amostras de tratamento sem controlos não é recomendado.

6) Anotação de Picos

O objetivo da anotação é associar o ChIP-seq picos com regiões genómicas funcionalmente relevantes, como promotores de genes, locais de início de transcrição, regiões intergénicas, etc.

7) Análise de Motivos

A análise de motivos é útil para muito mais do que apenas identificar o motivo de ligação ao DNA causal nos picos de ChIP-seq de fatores de transcrição.

Quando o motivo da proteína ChIPada já é conhecido, a análise de motivos fornece validação do sucesso do experimento.

Aplicação da Análise de Dados ChiP-Seq

ChIP-Seq é uma técnica amplamente aplicada na investigação biológica. Ela explora a compreensão das interações entre proteínas e DNA na cromatina, elucidando assim os mecanismos regulatórios dos genes, a epigenética e os processos envolvidos na progressão e desenvolvimento de doenças. Desequilíbrios epigenéticos entre estados de doença e saudáveis podem envolver alterações nas modificações de histonas e fatores de transcrição. Neste ponto, ChIP-Seq A investigação tem sido utilizada para clarificar as patologias moleculares do câncer e de outras doenças. Também tem potenciais implicações na derivação de novos alvos para o diagnóstico e tratamento de doenças.

Figura 4. ChIP-Rx Revela Alterações Epigenómicas em Células doentes que Respondem ao Tratamento com Medicamentos. (Orlando et al., 2014)

ChIP-Seq também se mostraram valiosos na compreensão do papel dos fatores de transcrição durante a progressão da doença. Esta ferramenta permite a identificação de locais de ligação de fatores de transcrição e regiões de regulação genética, como locais de modificação de histonas, aprofundando assim a compreensão dos mecanismos que governam a regulação genética. A análise de ChIP-Seq pode determinar os padrões de distribuição de modificações de histonas e metilação do DNA ao longo do genoma, revelando assim redes regulatórias epigenéticas e o impacto dessas modificações na expressão gênica e nas funções celulares. Os resultados de ChIP-Seq são frequentemente utilizados em anotações funcionais para determinar os processos biológicos e vias em que as regiões regulatórias do genoma podem participar. Esta perspetiva clarifica a funcionalidade biológica de diferentes regiões genómicas, promovendo a nossa compreensão das intrincadas dinâmicas celulares.

Como uma técnica amplamente aplicada em diversos campos da pesquisa biológica, incluindo biologia do desenvolvimento, oncologia e imunologia, Sequenciação por Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP-Seq) oferece insights vitais sobre a regulação genética e os mecanismos da doença. Com o contínuo aprimoramento e avanço desta técnica, o seu papel na revelação de mecanismos regulatórios intrincados dentro do genoma e na decifração de vias da doença tornará-se cada vez mais saliente e abrangente.

Leitura adicional:

As Vantagens e o Fluxo de Trabalho do ChIP-Seq

Referências:

1. Bailey, T., Krajewski, P., Ladunga, I., et al. Diretrizes práticas para a análise abrangente de dados de ChIP-seq. PLoS biologia computacional, 2013, 9, e1003326.
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3. Furey, T.S. ChIP-seq e além: novas e melhoradas metodologias para detectar e caracterizar interacções proteína-DNA. Nature Reviews Genetics, 2012, 13, 840-852.
4. Landt, S.G., Marinov, G.K., Kundaje, A., et al. Diretrizes e práticas de ChIP-seq dos consórcios ENCODE e modENCODE. Pesquisa genómica, 2012, 22, 1813-1831.
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7. Nakato, R., e Shirahige, K. Avanços recentes na análise de ChIP-seq: da gestão de qualidade à anotação do genoma completo. Briefings em bioinformática, 2017, 18, 279-290.
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9. Thomas-Chollier, M., Herrmann, C., Defrance, M., Sand, O., Thieffry, D., e van Helden, J. RSAT peak-motifs: análise de motivos em conjuntos de dados ChIP-seq de tamanho completo. Pesquisa em ácidos nucleicos, 2012, 40, e31.
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