ChIP-Seq: Uma Ferramenta Versátil para a Epigenómica

O que é ChIP-Seq?

ChIP-seq é uma das técnicas mais importantes para o perfilamento em todo o genoma de proteínas que se ligam ao DNA, modificações de histonas ou nucleossomas. Oferece maior resolução, menos ruído e maior cobertura do que o ChIP-chip. O ChIP-seq combina sequenciação de próxima geração (NGS) com imunoprecipitação de cromatina. O ChIP-seq tem sido utilizado como uma ferramenta versátil em epigenómica. Por um lado, pode detetar modificações de histonas; por outro, pode revelar as interacções entre DNA e proteínas. in vivoÉ essencial para decifrar redes regulatórias de genes, permitindo uma compreensão completa da regulação transcricional.

A Contribuição do ChIP-Seq para o Mapeamento do Epigenoma

Mapas de ligação de fatores de transcrição
Decifrar as redes de regulação genética que subjazem a vários processos biológicos.

2. Mapas de modificação de histonas
Como a metilação, trimetilação, acetilação, etc..

3. Mapas de nucleossomas
Revele o papel dos nucleossomas na regulação transcricional.

Como Funciona o ChIP-Seq?

Num experimento de ChIP, a proteína de ligação ao DNA é entrelaçada ao DNA. in vivo através do tratamento com formaldeído, e a cromatina é fragmentada em fragmentos de 200-600 pb. A digestão com nuclease micrococó (MNase) sem entrelaçamento é frequentemente utilizada para fragmentar a cromatina, uma vez que o tratamento com MNase remove o DNA de ligação de forma mais eficiente do que a sonicação. No entanto, a digestão com MNase apresenta um viés de sequência mais pronunciado. Um anticorpo específico para a proteína de interesse é utilizado para a imunoprecipitação. A qualidade do anticorpo é muito importante para gerar dados de ChIP ou ChIP-seq de alto valor. Subsequentemente, os entrelaçamentos são revertidos e o DNA é liberado para a preparação da biblioteca de NGS. O DNA imunoprecipitado é primeiro submetido a seleção de tamanho (comumente na faixa de 150-300 pb). Finalmente, os dados de ChIP-seq são gerados nas plataformas de NGS, como as plataformas Illumina. Um aumento na profundidade de sequenciamento permite a detecção de locais mais raros.

ChIP-seq de Não-Histonas e ChIP-seq de Histonas

O ChIP-seq pode ser dividido em ChIP-seq de não-histonas e ChIP-seq de histonas, dependendo do anticorpo utilizado na etapa de ChIP.

Pipeline de Bioinformática para ChIP-Seq

As sequências brutas precisam ser processadas para interpretar os experimentos de ChIP-seq.

(i) Filtragem de leituras de baixa qualidade

Primeiro, é necessário remover leituras de baixa qualidade e contaminantes, e aparar sequências de adaptadores.

(ii) Alinhar leituras ao genoma

Em segundo lugar, alinhe as leituras ao genoma do gene utilizando BWA, Bowtie, GSNAP ou a lista de alinhadores da Wikipedia.

(iii) Filtrar artefatos e leituras alinhadas a múltiplos locais

Em terceiro lugar, filtre os artefatos criados na etapa de amplificação PCR e as leituras alinhadas a múltiplas localizações.

(iv) Chamada de picos

Ferramentas como MACS, PeakSeq e ZINBA podem identificar regiões genómicas de enriquecimento de sinal, como uma proteína ligada, modificação de histonas ou cromatina aberta. A chamada diferencial de picos pode ser implementada usando edgeR, DESeq, baySeq ou SAMSeq.