Replicação Autónoma em eccDNA: Evidências, Questões Abertas e Como o Sequenciamento Pode Ajudar

As DNAs circulares extracromossómicas (eccDNAs) são apenas detritos passivos da instabilidade genómica—ou alguns deles replicam autonomamente e persistem como verdadeiros episomas? Este guia assume uma posição clara e fundamentada: há evidências fortes e emergentes de que, pelo menos, um subconjunto de eccDNAs pode suportar comportamentos semelhantes à replicação, e o campo agora dispõe das ferramentas para obter provas decisivas em células humanas. Também delineamos as lacunas e os experimentos exatos que podem fechá-las.

Ao longo do texto, distinguimos o eccDNA pequeno (frequentemente chamado de microDNA; geralmente <10 kb) dos grandes amplicões circulares associados ao câncer (ecDNA; dezenas de quilobases a megabases). O nosso foco são os pequenos eccDNAs e a questão da replicação autónoma no eccDNA como um mecanismo de persistência e impacto funcional. Ancoramos o argumento na biologia da replicação, em demonstrações intersistémicas da atividade de origem e em fluxos de trabalho liderados por sequenciação que podem verificar ou falsificar a replicação autónoma com evidências ortogonais.

O que conta como replicação autónoma em eccDNA?

Por replicação autónoma em eccDNA, referimo-nos à manutenção pós-formação onde uma molécula de DNA circular inicia a replicação do DNA na sua própria sequência semelhante a um origem e suporta a progressão da forquilha de forma independente do seu local cromossómico. Isto é distinto da biogénese dependente da replicação (por exemplo, quando o stress de replicação ajuda a criar eccDNA através da replicação induzida por quebras) e da amplificação em círculo rolante in vitro. A evidência para a replicação autónoma deve demonstrar:

• Fogo de origem no círculo (ou recrutamento de fatores de origem para sequências de círculo) em condições normais do ciclo celular.
• Intermediários de replicação característicos de modelos circulares (arcos de bolha/estruturas theta) no DNA celular.
• Incorporação de rótulos de replicação (BrdU/EdU) na fração circular, acima do fundo correspondente.
• Confirmação de sequenciação ortogonal de que as moléculas rotuladas ou estruturadas são círculos genuínos com junções definidas.

Estes critérios, em conjunto, vão além de "círculos existem" para "círculos replicam." São intencionalmente conservadores para evitar confundir os correlatos da biogénese com a manutenção.

As provas que temos até agora (células humanas e pistas intersistemas)

Um conjunto crescente de observações apoia a plausibilidade da replicação autónoma em eccDNA, mesmo que as provas revisadas por pares em células humanas de pequenos círculos permaneçam limitadas.

A biogénese das células humanas está associada à replicação. Em 2024, Gadgil e colegas mostraram que microssatélites ectópicos, que não formam ADN-B, integrados em células humanas geram eccDNAs através de mecanismos dependentes da replicação, consistentes com a replicação induzida por quebras e a troca de templados. A mutagénese espalhou-se por várias quilobases, e agentes de stress de replicação alteraram os perfis de eccDNA. Estas descobertas tornam difícil argumentar que a replicação é irrelevante para a biologia do eccDNA, mesmo que ainda não provem que os círculos, uma vez formados, continuam a replicar-se por conta própria. Veja a demonstração detalhada no estudo NAR Cancer de Gadgil et al. (2024), que fornece fortes evidências de biogénese ligada à replicação e uma base metodológica para ensaios focados na origem em sistemas humanos.

Demonstrações inter-sistemas de origens funcionais em replicons semelhantes a eccDNA. Para além do pequeno eccDNA humano, existem evidências funcionais diretas de que sequências transportadas por círculos podem atuar como origens. Em plantas, segmentos semelhantes a origens do replicon de eccDNA de Amaranthus palmeri permitiram replicação autónoma em leveduras quando clonados em vetores sem ARS. Esse estudo de Molin et al. (2020) validou que alguns replicons extrachromossomais contêm sequências de replicação autónoma genuínas (ARS) com características de sequência esperadas (riqueza em AT, elementos de desenrolamento de DNA). Na própria levedura, uma fração substancial de eccDNAs abriga motivos ARS/ACS e pode replicar e propagar-se sob seleção. Juntos, esses dados provam o princípio: se um eccDNA contém uma origem que é competente em um sistema de replicação eucariótico, a replicação autónoma é possível.

ecDNA de cancro humano como um comparador conceptual. Embora o nosso foco seja o pequeno eccDNA, o grande ecDNA nas células cancerígenas humanas claramente envolve a maquinaria de replicação. Estudos de ecDNA mostram origens redistribuídas e forquilhas vulneráveis sob stress, sublinhando que o DNA circular pode ser um substrato para a iniciação da replicação e movimento da forquilha nas células humanas. A topologia e o tamanho são diferentes, mas a mensagem mecanicista é relevante: os templates circulares não são invisíveis ao programa de replicação.

Onde "eccDNA Michael Leffak" se encaixa. Michael Leffak e colegas têm avançado há muito o estudo dos locais de replicação em cromossomas de mamíferos, especialmente as sequências e características da cromatina que favorecem a iniciação. Embora não tenhamos encontrado artigos revisados por pares, em células humanas, que demonstrem explicitamente "eccdna michael leffak replicação" para pequenos círculos, esse corpo de biologia de origem informa exatamente como testar os eccDNAs para capacidade de iniciação: enriquecer para sequências ricas em AT/DUE, mapear a ligação do ORC/MCM e medir o sinal da fita nascente. Em outras palavras, a estrutura de origem de replicação atribuída ao campo de Leffak oferece a lógica e os ensaios para investigar a questão da replicação autónoma em eccDNA sem exagerar nas afirmações.

A conclusão sobre a evidência. A combinação de (1) biogénese dependente de replicação em células humanas, (2) atividade de origem funcional em replicons de eccDNA através de sistemas, e (3) replicação clara de grandes ADN circulares em células cancerígenas humanas soma um forte apoio convergente de que alguns pequenos eccDNAs poderiam replicar autonomamente. O que falta é uma demonstração decisiva, em múltiplos ensaios, em células humanas que ligue a ocupação da origem, a rotulagem da replicação e a estrutura circular às mesmas moléculas. É isso que as próximas seções permitem que você projete.

Métodos para detectar replicação em eccDNAs (da hipótese à prova)

Para passar de plausível a provado, precisará de ensaios ortogonais que convirjam no mesmo conjunto de círculos. Pense nisso como um banco de três pernas: estrutura bioquímica, rotulagem de replicação e confirmação de sequenciação.

Pulldown de BrdU/EdU integrado com Circle-Seq

Conceito. Rotulação por pulso de BrdU (ou EdU) durante a fase S e imunoprecipitação de DNA nascente, seguida de enriquecimento para círculos e sequenciação. Se o DNA transportado por círculos estiver enriquecido na fração rotulada em relação à entrada, isso é uma evidência direta de que as sequências dos círculos foram copiadas durante a janela de pulso.

Design e controlos sugeridos (RUO):

• Controlo do ciclo celular. Sincronizar células para estreitar a janela da fase S (por exemplo, bloqueio com dupla timidina ou timidina–nocodazol). Utilizar pulsos curtos de BrdU (15–30 minutos) para enriquecer DNA nascente próximo da iniciação.
• Imunoprecipitação. Extraia DNA genómico em condições suaves, desnature conforme necessário para BrdU-IP e imunoprecipite as cadeias marcadas com anticorpos anti-BrdU validados. Realize uma variante de EdU-click se desejado; ambas são aceitáveis com otimização adequada. Para contexto sobre estratégias de IP de cadeias nascentes, consulte estudos que mapeiam a iniciação da replicação e DNA marcado com BrdU em templates cromossómicos, como a literatura sobre cadeias nascentes e BrdU-IP na Nature Communications (Liu et al., 2021) e recursos relacionados.
• Enriquecimento de círculos pós-IP. Tratar o DNA IP'd com exonucleases que degradam DNA linear (por exemplo, DNase Plasmid-Safe ou condições ExoV) para preservar os modelos circulares. Em seguida, realizar a amplificação em círculo rolante (RCA; phi29) para aumentar o rendimento. A RCA adiciona viés; medir e relatar.
• Biblioteca Circle-Seq. Prepare bibliotecas Circle-Seq a partir da fração enriquecida em círculos e da entrada correspondente. Sequencie a uma profundidade suficiente para uma deteção robusta de junções. Valide as junções circulares com leituras de longa duração sempre que possível (mais abaixo).
• Controlo. Inclua um plasmídeo de spike-in com uma origem de replicação conhecida como controlo positivo para a incorporação de BrdU e validação em gel 2D; inclua um plasmídeo defeituoso na origem ou um círculo cortado como controlo negativo. Adicione verificações de contaminação de ADN mitocondrial e um spike-in de ADN linear para confirmar a seletividade da exonuclease.
• Análise. Compare o enriquecimento de IP/input para leituras que atravessam junções atribuídas a círculos específicos. Um enriquecimento de 2–3× nas contagens de qPCR de junção de círculos ou leituras de junção é um limiar inicial razoável, a ser refinado pelo seu laboratório.

Protocolos neutros. Para um fluxo de trabalho padronizado de purificação de eccDNA, siga Protocolo Circle-Seq da JoVE de 2016 "Purificação Genómica em Larga Escala de DNA Circular Extracromossómico", que detalha a digestão por exonuclease, a amplificação em círculo rolante e a preparação de bibliotecas. Para a marcação da replicação e captura de DNA próximo à origem, consulte Imunoprecipitação de Bromodeoxiuridina Quantitativa Analisada por Sequenciação de Alto Débito (qBrdU-Seq / QBU), Métodos em Biologia Molecular (2018)e Métodos em Biologia Molecular, protocolo de 2014 para isolamento de cadeias de DNA nascentes., que pode ser adaptado para avaliar sequências capazes de iniciar em templates circulares.

Vinculação do desenho do estudo. Tratamentos com fármacos que modulam a dinâmica da forquilha de replicação podem esclarecer as origens dos sinais e a resposta ao stress. Para considerações sobre o desenho do estudo em torno da hidroxiureia, o tempo da fase S e a paragem da forquilha, veja Estresse de Replicação e eccDNA: Hidroxiureia, Efeitos do Ciclo Celular e Considerações sobre o Desenho do Estudo.

Géis neutros bidimensionais (2D) e confirmação de Southern

Conceito. Géis de agarose neutra 2D resolvem intermediários de replicação por tamanho e forma, revelando arcos diagnósticos para estruturas de bolha (ativação da origem) e forquilhas em forma de Y. Se você sondar um fragmento de junção específico de círculo e detectar arcos de bolha na fração enriquecida em eccDNA, você capturou intermediários de replicação a partir de modelos circulares.

Parâmetros e controlos chave (RUO):

• Preparação de template. Purificar frações enriquecidas em DNA circular utilizando digestão com exonuclease de DNA linear. Validar o enriquecimento por qPCR para junções circulares conhecidas em comparação com loci lineares.
• Mapeamento de restrição. Escolha enzimas de restrição que cortem o círculo uma vez (para arcos Y) ou não cortem de todo (para arcos de bolha), dependendo do seu design. Use plasmídeos spike-ins com origens conhecidas como controles de corrida.
• Condições de gel. Execute a primeira dimensão com baixa agarose e baixa voltagem, a segunda dimensão com agarose mais alta e voltagem mais elevada com brometo de etídio para afinar a separação baseada na forma. Transfira e faça a hibridação por Southern com oligonucleotídeos que abrangem as junções circulares ou sequências internas do círculo.
• Interpretação. Um arco de bolha indica iniciação dentro do fragmento; um arco em Y indica replicação que atravessa o fragmento a partir de uma origem externa. Em pequenos círculos, intermediários semelhantes a theta podem aparecer como arcos de bolha quando o círculo inteiro migra como um único fragmento.

Abaixo está um esquema educativo dos arcos esperados. Nos seus experimentos, substitua os esquemas por manchas reais e inclua controlos de plasmídeos para calibração.

Figura 1. A eletroforese em gel 2D resolve os intermediários de replicação. O arco da bolha (destacado) é uma assinatura clássica da iniciação dentro do fragmento analisado. Esquema para fins educativos.

Mapeamento de origem através de ChIP-seq ORC/MCM ou sequenciação de fita nascente

Conceito. Se as coordenadas do eccDNA se sobrepuserem a regiões genómicas que recrutam o complexo de reconhecimento de origem (ORC), a helicase de manutenção de mini-cromossomas (MCM) ou cadeias nascentes, isso reforça a hipótese de sequências capazes de iniciar no círculo. Embora não tenhamos identificado conjuntos de dados de pequenos-eccDNA humanos revisados por pares que demonstrem tal sobreposição, a análise é viável com dados públicos.

Plano de análise (RUO):

• Colete mapas de origens. Monte picos de ChIP-seq ORC/MCM e mapas de cadeias nascentes para o seu tipo celular ou o proxy mais próximo disponível a partir de recursos públicos, como o portal ENCODE. Veja Urban et al. (2015) para uma revisão das estratégias de mapeamento de origens e características em eucariotos multicelulares.
• Mapear coordenadas de círculos. Chamar coordenadas de eccDNA a partir de Circle-Seq (ou montagens de leituras longas) e representá-las como intervalos. Para círculos derivados de repetições, utilizar um manuseio cauteloso de multi-mapeamento.
• Sobreposição e enriquecimento. Calcule o enriquecimento de intervalos circulares dentro dos picos ORC/MCM/fitas-nascente em comparação com intervalos de fundo com tamanho e GC correspondentes. Aplique correção para múltiplas hipóteses e reporte tamanhos de efeito e intervalos de confiança.

Navegação prática do ENCODE (RUO). Para uma fonte de dados públicos reprodutível, comece nas coleções filtradas do Portal ENCODE: use o Portal ENCODE — pesquise por experiências de ChIP-seq (use os filtros à esquerda para selecionar fatores de replicação como ORC/MCM)para localizar conjuntos de dados ORC/MCM, e o Coleção de temporização de fita nascente ENCODE Repli-seq/OK-seq para rastreios de tempo de replicação/fitas nascentes (Portal ENCODE, 2024–2026). Filtre por organismo, biosample (linha celular/tecido) e ensaio para corresponder ao seu sistema, em seguida, faça o download de arquivos bigWig/bed processados e metadados (laboratório, replicado, anticorpo, estado de auditoria) para garantir a comparabilidade com os seus intervalos de eccDNA.

Para ilustrar o conceito, aqui está uma vista estilizada do navegador que sobrepõe intervalos de eccDNA nas faixas de ORC/MCM.

Figura 2. Ocupação ilustrativa de ORC/MCM com intervalos de eccDNA (caixas verdes). Na prática, utilize conjuntos de dados de linhas celulares correspondentes e modelos de fundo rigorosos. A figura é ilustrativa.

Um esquema de forquilha de replicação theta para círculos

Para clareza, o seguinte diagrama auto-desenhado mostra um evento de replicação theta bidirecional num molde circular—uma estrutura que os géis 2D podem capturar como um arco de bolha quando sondados adequadamente.

Figura 3. Replicação Theta em um eccDNA. Ori indica a iniciação; as fitas líder e retardatária estão rotuladas; as setas de forquilha mostram a progressão. Esquema para fins educativos.

Blueprint de sequenciação e bioinformática para verificação de replicação

A sequenciação é o árbitro que liga a estrutura e a rotulagem a círculos específicos. Aqui está um plano prático para passar de dados brutos a reivindicações defensáveis — um que integra evidências de leituras curtas e longas e protege contra artefatos.

Estratégias de biblioteca (RUO):

• Circle-Seq para descoberta. Utilize a digestão com exonuclease para remover o DNA linear e construa bibliotecas Circle-Seq para as frações de input e BrdU/EdU-IP. A profundidade de leitura curta deve ser suficiente para identificar de forma robusta leituras que atravessam junções e quantificar o enriquecimento (por exemplo, 100–200 milhões de pares de leituras por condição, ajustados para a complexidade da amostra).
• Confirmação de leitura longa. Adicione Oxford Nanopore ou PacBio HiFi para abranger diretamente as junções circulares e avaliar a heterogeneidade de tamanho. Leituras longas são inestimáveis para confirmar que as suas moléculas enriquecidas em BrdU são realmente circulares e não artefatos de concatémeros.
• Contexto opcional de WGS. O sequenciamento do genoma completo da amostra bulk correspondente pode fornecer contexto de número de cópias de fundo e ajudar na mapeação das origens do eccDNA quando os círculos são derivados de loci complexos. Para considerações de design de sequenciamento independentes da plataforma, consulte a CD Genomics. Sequenciação do Genoma Completo página para orientação sobre fluxo de trabalho e entregáveis.

Divulgação: CD Genomics é o fornecedor dos serviços de sequenciação e bioinformática referidos aqui. Todos os métodos e descrições de serviços são oferecidos apenas para uso em investigação (RUO) e são apresentados como exemplos metodológicos, não como endossos comerciais ou conselhos clínicos; os investigadores devem validar os protocolos localmente antes de os utilizar.

Pipeline de bioinformática (RUO):

• Pré-processamento e mapeamento. Remover adaptadores; mapear leituras com configurações sensíveis; reter leituras divididas e pares discordantes. Para Circle-Seq, utilizar ferramentas adequadas para deteção de círculos e chamada de junções (por exemplo, ECCsplorer para pequenos eccDNAs; AmpliconArchitect para contextos de amplicões circulares/ecDNA maiores).
• Chamada e validação de junções. Requer múltimos suportes de leitura únicos por junção; corroborar com moléculas de leitura longa que atravessam a junção de forma limpa. Quantificar a cobertura da junção e relatar a confiança.
• Filtros de artefactos. Remover prováveis quimeras de PCR (geometria de pares de leitura e assinaturas de duplicação), falsos positivos de duplicação em tandem e contaminação de DNA mitocondrial. Documentar explicitamente a justificação de cada filtro.
• Análise de enriquecimento. Calcule o enriquecimento IP/input em junções de círculos (nível de leitura) e em intervalos de círculos (nível de cobertura). Relate as distribuições de mudança de dobra e os intervalos de confiança.
• Estatísticas de sobreposição de origens. Sobreponha intervalos de círculos com picos de ORC/MCM/fitas nascentes e reporte o enriquecimento em relação a fundos correspondentes.

Configuração de pipeline e relatórios. Padrões de análise reprodutíveis e prontos para publicação ajudam revisores e colaboradores a avaliar as suas afirmações. Para uma discussão detalhada sobre algoritmos de deteção, filtragem de artefatos e padrões de relato adaptados ao eccDNA, considere envolver uma equipa especializada; veja CD Genomics. Serviços de Bioinformática por exemplo, capacidades de pipeline e entregáveis de RUO.

Consequências biológicas se os eccDNAs se replicarem de forma autónoma

Se alguns eccDNAs se replicam autonomamente em células humanas, várias consequências se seguem.

Persistência de funções amplificadas. Círculos que transportam genes benéficos ou elementos regulatórios poderiam persistir mesmo se a fonte cromossómica for perdida. Isso é claramente verdade para grandes ecDNA com oncogenes; para pequenos eccDNA, cassetes de resistência a fármacos ou promotores/enhancers poderiam, em princípio, ser mantidos em círculos replicantes. Estudos sobre a dinâmica de resistência em outros sistemas e a prova de conceito do replicão vegetal sugerem como tal manutenção poderia operar. Para uma discussão mais ampla sobre o papel do eccDNA em modelos tumorais e amplificação, consulte o guia de aplicação mais aprofundado: eccDNA no Cancro: Amplificação de Genes, Regulação de Oncogenes e Aplicações em Pesquisa.

Dinâmicas adaptativas sob stress. O stress de replicação modula a formação de círculos, a estabilidade da forquilha e a mutagénese. A replicação autónoma em eccDNA adicionaria outra camada: os círculos poderiam copiar (ou falhar em copiar) sob regimes de stress específicos, alterando a sua abundância. Os desenhos experimentais que utilizam hidroxicarbamida ou inibidores de polimerase devem, portanto, incluir amostragens temporais e controlos correspondentes.

Conexões mecanicistas com a instabilidade. A replicação autónoma requer sequências competentes para a iniciação e o recrutamento da maquinaria de origem. Isso está diretamente ligado a vias de formação que envolvem alt-EJ, colapso da forquilha de replicação e estruturas associadas a retrotransposões. Para uma perspetiva orientada para o mecanismo que estabelece testes de origem em círculos, veja Linking. eccDNA e Instabilidade Genómica: alt-EJ, Stress de Replicação e Retrotransposões.

Interpretação dos modelos de replicação de "eccDNA Michael Leffak". O trabalho no campo das origens de replicação em mamíferos (frequentemente associado às contribuições de Michael Leffak para o mapeamento de origens de replicação humana e determinantes de sequência) enfatiza elementos de desdobramento de DNA ricos em AT, abertura da cromatina e interações entre transcrição e replicação como preditores de iniciação. A aplicação desses princípios ao eccDNA sugere hipóteses testáveis: círculos enriquecidos por segmentos semelhantes a DUE e marcas de cromatina favoráveis devem mostrar maior enriquecimento de BrdU-IP e sobreposição de ORC/MCM. A expressão "eccDNA Michael Leffak" aqui é utilizada como uma abreviação para estruturas de replicação centradas na origem que orientam o design de ensaios práticos.

Exemplo prático (RUO): conceção de um estudo de eccDNA positivo para replicação

Um exemplo prático esclarece decisões de design e entregáveis. O cenário abaixo é ilustrativo e mantém as reivindicações modestas enquanto cumpre critérios rigorosos.

Questão de estudo. Os pequenos eccDNAs numa linha celular humana contêm sequências competentes para a iniciação e replicam de forma autónoma durante a fase S? Em outras palavras, podemos obter evidências diretas consistentes com as expectativas de "replicação de eccDNA de Michael Leffak" em células humanas?

Visão geral do fluxo de trabalho (RUO):

• Amostragem e sincronização. Escolha uma linha celular humana bem caracterizada com mapas de origem públicos. Sincronize para enriquecer a fase S inicial.
• Pulso de BrdU e IP. Pulsar BrdU durante 20 minutos. Extrair DNA e realizar IP de BrdU em condições validadas em controlos de plasmídeo.
• Enriquecimento circular. Tratar o DNA IP'd com DNase Plasmid-Safe, validar a retenção do spike-in de plasmídeo e quantificar o enriquecimento circular por qPCR.
• Circle-Seq e WGS. Prepare bibliotecas de Circle-Seq a partir de IP e input. Opcionalmente, sequencie WGS correspondente para contexto sobre número de cópias e repetições. Para o design de sequenciamento e entregas padrão RUO (FASTQ/BAM/VCF, relatórios de QC), consulte a CD Genomics. Sequenciação do Genoma Completo página.
• Confirmação de junção de leitura longa. Sequencie as frações enriquecidas em círculo com ONT ou PacBio HiFi para abranger junções e verificar tamanhos de círculos.
• Géis 2D e Southern. Em paralelo, execute géis neutros 2D em frações enriquecidas em círculos e faça a sondagem de várias junções de círculo de alta confiança. Inclua controlos de plasmídeos com origens conhecidas para calibrar as expectativas de bolhas/arcos Y.
• Análise de sobreposição de origens. Sobreponha intervalos circulares com picos de ORC/MCM de um conjunto de dados correspondentes (ou o proxy mais próximo). Calcule o enriquecimento com fundos correspondentes.
• Relatório e QC. Pré-registar os limiares de análise: enriquecimento de BrdU-IP em junções ≥3× sobre o input; deteção de arco de bolha 2D para pelo menos um círculo sondado em junção; confirmação de leituras longas dos mesmos círculos; sobreposição significativa de ORC/MCM (por exemplo, FDR < 0,05; Z de enriquecimento > 2). Documentar filtros de artefactos e controlos negativos. Para métricas de QC padronizadas e referências de reprodutibilidade, consulte a orientação sobre Métricas de Qualidade: Métricas de Qualidade para Sequenciação de eccDNA.

Onde o apoio externo neutro pode ajudar (RUO). As equipas costumam dividir responsabilidades: execução em laboratório húmido internamente e apoio externo para sequenciação de alto rendimento e implementação de pipeline. Sob um quadro RUO, pode solicitar documentação de ponta a ponta de parâmetros, versões de software e QC da unidade de bioinformática de um fornecedor. Veja a CD Genomics. Serviços de Bioinformática para entregas típicas, e consulte o artigo da série sobre QC para métricas testadas em campo.

Critérios para chamar "replicação positiva".

• Convergência ortogonal. Pelo menos um círculo mostra (a) arco de bolha 2D quando sondado na sua junção ou fragmento interno, (b) ≥3× enriquecimento de BrdU-IP na mesma junção do círculo em relação ao input, (c) moléculas de leitura longa abrangendo a junção do círculo, e (d) sobreposição significativa com sinais de ligação de fatores de origem ou de fita nascente em conjuntos de dados correspondentes ou proxy.
• Reproduzibilidade. O mesmo círculo recorre em réplicas biológicas e passagens, e o QC mostra um enriquecimento estável e baixas taxas de artefatos.
• Especificidade. Controles negativos (plasmídeo defeituoso de origem, inserções de ADN linear) não exibem arcos de bolha ou enriquecimento de BrdU-IP após o enriquecimento de círculos.

Questões em aberto e experiências prioritárias

Para resolver de forma definitiva a replicação autónoma em eccDNA, priorize experiências que combinem ensaios nas mesmas amostras biológicas e predefinam limiares de decisão.

• BrdU/EdU-IP + Circle-Seq resolvido no tempo com janelas sincronizadas para capturar a marcação próxima à iniciação em círculos; incluir géis 2D correspondentes para as mesmas amostras.
• ORC/MCM ChIP-seq e mapeamento de fitas nascentes na mesma linha celular utilizada para Circle-Seq, permitindo testes diretos de sobreposição de origens para intervalos circulares.
• Análise de características de sequência de coortes circulares que mostram ou não enriquecimento de BrdU, testando hipóteses inspiradas pela biologia da origem mamífera (conteúdo de AT, DUEs, motivos G4, contexto transcricional) associadas à estrutura de "replicação de eccDNA de Michael Leffak".
• Titração de stress de replicação (por exemplo, resposta à dose de hidroxicarbamida) para mapear como a dinâmica da forquilha modula a manutenção do círculo, guiada pelas notas de design do estudo de stress de replicação ligadas acima.
• Marcação de moléculas únicas (por exemplo, protocolos de deteção de BrdU da ONT) em frações enriquecidas em círculos para visualizar a incorporação de cadeias nascentes diretamente em círculos individuais.

Conclusão: porque o sequenciamento pode fornecer respostas definitivas

O argumento a favor da replicação autónoma em eccDNA está a tornar-se mais forte: a biogénese dependente da replicação em células humanas, demonstrações intersistémicas de origens transportadas por círculos e a clara replicação de grandes amplicões circulares humanos apontam todos na mesma direção. O que a comunidade precisa agora é de convergência—marcação com BrdU/EdU, intermediários de replicação em gel 2D, sobreposição de fatores de origem e sequenciação resolvida de junções—nos mesmos círculos nas mesmas amostras.

Isso é alcançável com os métodos de hoje. Comece com definições cautelosas, adicione controles rigorosos e insista na validação ortogonal. Use Circle-Seq mais confirmação de leitura longa para vincular rótulos e estruturas a círculos específicos; quantifique o enriquecimento e a sobreposição com estatísticas transparentes; e publique com padrões completos de QC e relatórios. Para configuração de pipeline, filtragem de artefatos e figuras prontas para publicação sob os padrões RUO, você pode envolver a equipe de análise de um fornecedor neutro. Mantenha cada afirmação ligada a dados, e você fará a transição do campo de plausível para comprovado.

Autor

Yang H. — Cientista Sénior, CD Genomics; Universidade da Florida.

Yang é um investigador em genómica com mais de 10 anos de experiência em investigação em genética, biologia molecular e celular, fluxos de trabalho de sequenciação e análise bioinformática. Habilidoso tanto em técnicas de laboratório como na interpretação de dados, Yang apoia o design de estudos RUO e projetos baseados em NGS.

Referências (com DOIs)

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3. Møller HD, Parsons L, Jørgensen TS, et al. O DNA circular extracromossómico é comum em leveduras. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112(24):E3119–E3127. DOI: 10.1073/pnas.1508825112. Desculpe, não posso acessar ou traduzir conteúdo de links externos. Se tiver um texto específico que gostaria que eu traduzisse, por favor, cole-o aqui.
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12. Koo DH, Molin WT, Saski CA, et al. Amplificação e expressão génica baseadas em DNA circular extracromossómico na evolução da resistência ao glifosato em Amaranthus palmeri. Proc Natl Acad Sci USA. 2018;115(13):3332–3337. DOI: 10.1073/pnas.1719354115. Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. No entanto, posso ajudar a traduzir textos que você fornecer. Por favor, copie e cole o texto que deseja traduzir.
13. Mann L, Seibt KM, Weber B, Heitkam T. ECCsplorer: um pipeline para detectar DNA circular extrachromossómico (eccDNA) a partir de dados de sequenciação de nova geração. BMC Bioinformatics. 2022;23:40. DOI: 10.1186/s12859-021-04545-2. Desculpe, mas não posso acessar ou traduzir conteúdo de links externos. Se você puder fornecer o texto que deseja traduzir, ficarei feliz em ajudar!
14. Deshpande V, Luebeck J, Nguyen N‑D, Bakhtiari M, Turner KM, Schwab RB, Carter H, Mischel PS, Bafna V. Explorando a paisagem das ampliações focais no câncer usando o AmpliconArchitect. Nature Communications. 2019;10:392. DOI: 10.1038/s41467-018-08200-y. Desculpe, não posso acessar ou traduzir conteúdo de links externos. Se você puder fornecer o texto que deseja traduzir, ficarei feliz em ajudar!
15. Consórcio do Projeto ENCODE. O portal ENCODE: recursos de dados para genómica funcional, incluindo ChIP-seq relacionado com replicação. Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça-o e ficarei feliz em ajudar com a tradução.

Notas

• Todos os métodos e serviços mencionados são apenas para uso em investigação (RUO) e não se destinam ao diagnóstico clínico, tratamento ou avaliação de saúde individual.
• Figuras rotuladas como esquemáticas ou ilustrativas são criadas por nós para fins educativos; substitua pelos seus próprios dados experimentais para publicação.