Fluxo de Trabalho de Bioinformática para Sequenciação do Genoma Completo

Visão Geral do WGS

Sequenciação do Genoma Completo (WGS) refere-se ao sequenciamento de alto rendimento de todo o genoma, permitindo a análise de variações entre diferentes indivíduos, bem como a anotação de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e características estruturais genómicas. O WGS, devido à sua natureza abrangente, fornece uma riqueza de informações além do que é alcançável através do sequenciamento do exoma ou sequenciamento direcionado, oferecendo assim vantagens únicas.

Além disso, os avanços nas tecnologias de sequenciação nos últimos anos, juntamente com a contínua redução dos custos de sequenciação, tornaram o WGS cada vez mais acessível. A sua superioridade na identificação de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), inserções e deleções (Indels) sublinha ainda mais a sua importância, tornando o WGS uma opção cada vez mais preferida tanto em investigações clínicas como fundamentais.

O WGS tem a capacidade de melhorar significativamente o conhecimento genómico e compreender os mistérios da vida ao utilizar as tecnologias de sequenciação genética mais avançadas. O WGS pode ser utilizado para a identificação de variantes, anotação do genoma, análise filogenética, construção de genomas de referência, entre outros. O WGS tenta cobrir o genoma completo, mas na verdade cobre 95% do genoma, enfrentando dificuldades técnicas na sequenciação de regiões como os centrómeros e telómeros. Outro desafio para o WGS é a gestão de dados. À medida que conjuntos de dados maiores se tornam mais acessíveis e económicos, a análise computacional será o fator limitante em vez da tecnologia de sequenciação. Aqui discutiremos o fluxo de trabalho de bioinformática para a deteção de variações genéticas no WGS para ajudá-lo a ultrapassá-lo.

Fluxo de Trabalho de Bioinformática para WGS

O fluxo de trabalho de bioinformática para WGS é semelhante ao da sequenciação do exoma completo. Pode ver o nosso artigo. Fluxo de Trabalho de Bioinformática para Sequenciação do Exoma CompletoO fluxo de trabalho de bioinformática para WGS divide-se nos seguintes passos: (1) controlo de qualidade das leituras brutas; (2) pré-processamento de dados; (3) alinhamento; (4) chamada de variantes; (5) montagem do genoma; (6) anotação do genoma; (7) outras análises avançadas com base no seu interesse de investigação, como a análise filogenética.

Figura 1. Fluxo de trabalho de bioinformática do sequenciamento de genoma completo.

QC e pré-processamento de leituras brutas

A relevância do controlo de qualidade reside na sua aplicação ao sequenciamento de nova geração (NGS), representado principalmente pela Illumina, que emprega principalmente a técnica de sequenciamento por síntese. A fabricação de nucleotídeos baseia-se em reações químicas, permitindo uma síntese contínua e extensão da cadeia de nucleotídeos do extremo 5' para o extremo 3'.

No entanto, ao longo deste processo de síntese, a eficácia da DNA polimerase diminui invariavelmente à medida que a cadeia de síntese cresce, e a sua especificidade começa a declinar. Isto manifesta inevitavelmente um dilema — à medida que avançamos, a taxa de erro de replicação dos nucleotídeos intensifica-se. A qualidade dos dados de sequenciação influencia inerentemente a nossa análise subsequente, sinalizando a importância de controlos de qualidade rigorosos.

Os dados obtidos diretamente do sequenciador envolvem todos os nucleótidos, independentemente da sua qualidade de sequenciação. Eles também podem conter erros e, possivelmente, incluir imprecisões experimentais. Entre os passos de controlo de qualidade, os dados brutos de sequenciação são introduzidos em software de controlo de qualidade, onde os nucleótidos de baixa qualidade ou não sequenciados, e os mal sequenciados, são eliminados. Estes passos resultam em dados de leitura de baixa qualidade filtrados por QC (dados limpos).

Dados limpos são, portanto, considerados isentos de erros de sequenciação. Suponha que os nossos dados brutos compreendam leituras (10.000 unidades); após a aplicação do controlo de qualidade, esta quantidade transformará em dados limpos (8.500 unidades).

Os ficheiros brutos (fastq) precisam de ser eliminados de leituras/sequências de baixa qualidade e sequências técnicas, como sequências de adaptadores. Este processo é importante para a deteção precisa e fiável de variações. O FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq) é uma ferramenta poderosa para QC de leituras brutas que gera resultados de dados estatísticos, incluindo estatísticas básicas, qualidade da sequência, pontuações de qualidade, conteúdo da sequência, conteúdo de GC, distribuição do comprimento da sequência, sequências sobre-representadas, gráficos de nível de duplicação de sequências, conteúdo de adaptadores e conteúdo de k-mer. Ferramentas como Fastx_trimmer e cutadapt podem ser usadas para o corte de leituras.

Alinhamento

O alinhamento refere-se à posição de fragmentos sequenciados curtos em relação a uma sequência de genoma de referência conhecida, para determinar a localização e as potenciais variações de cada fragmento dentro do genoma.

Os alinhamentos podem ajudar a identificar a localização precisa dos fragmentos de sequenciação no genoma de referência, revelando assim regiões e estruturas específicas dentro do genoma. Através do alinhamento, as diferenças entre a amostra sequenciada e o genoma de referência ajudam a identificar Polimorfismos de Nucleotídeo Único (SNPs), mutações de inserções e deleções, entre outros. O alinhamento é também um passo crítico na anotação de genes; ajuda a determinar as regiões dos genes, como exões, íntrons, promotores, exões e UTRs.

É necessário determinar um genoma de referência. O Mash permite-nos comparar as leituras de sequenciamento geradas com o conjunto de referência dos genomas RefSeq do NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq) para determinar a distância genética e a relação entre eles. O próximo passo é mapear as leituras controladas em termos de qualidade ao genoma de referência. O Burrows-Wheeler Aligner (BWA) e o Bowtie2 são dois algoritmos populares de alinhamento de leituras curtas. A saída do BWA e do Bowtie2 é o formato padrão de alinhamento/mapa de sequências conhecido como SAM, que facilita os passos seguintes. Alternativamente, o BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) é amplamente utilizado para alinhamento local.

Tabela 1. Os programas computacionais comuns para alinhamento de leituras.

Chamadas de variantes

Uma vez que as leituras estão alinhadas ao genoma de referência, as variantes podem ser identificadas comparando o genoma da amostra com o genoma de referência. As variantes detectadas podem estar associadas a doenças ou ser simplesmente ruído genómico não funcional. O formato de chamada de variantes (VCF) é o formato padrão para armazenar variações de sequência, incluindo SNPs (polimorfismos de nucleotídeo único), indels, variantes estruturais e anotações. A chamada de variantes pode ser complicada devido à alta taxa de identificações falsas positivas e falsas negativas de SNVs e indels. Os pacotes de software na Tabela 2 são úteis para melhorar a chamada de variantes.

Tabela 2. Os pacotes de software para chamada de variantes.

Na análise de sequenciamento de genoma completo (WGS), a deteção de variantes depende fortemente da pontuação de qualidade das bases de sequenciamento, uma vez que esta pontuação é um padrão integral (por vezes o único) para medir a precisão das nossas bases sequenciadas. A Recalibração da Pontuação de Qualidade das Bases (BQSR) constrói principalmente modelos de erro para as bases de sequenciamento através de aprendizagem automática e faz ajustes apropriados a estas pontuações de qualidade das bases.

Por último, o controlo de qualidade e a filtragem dos resultados das variantes são necessários. O objetivo do controlo de qualidade é descartar resultados falso-positivos na máxima medida possível, mantendo o maior número possível de dados precisos. O esquema de controlo de qualidade preferido é o GATK VQSR (Recalibração da Pontuação de Qualidade da Variante), que utiliza aprendizagem automática para treinar um modelo (modelo de mistura gaussiana) usando várias características dos dados, permitindo o controlo de qualidade dos dados das variantes.

Montagem do genoma

Montagem de novo é o processo de alinhar leituras sobrepostas para formar contigs mais longos (sequências contíguas maiores) e ordenar os contigs em andaimes (uma estrutura do genoma sequenciado). Se houver um genoma de referência de uma espécie relacionada, o método comum é primeiro gerar contigs de novo e depois alinhá-los ao genoma de referência para a montagem dos andaimes. Uma abordagem alternativa é o algoritmo "Alinhar-Dispor-Consenso". Este método primeiro alinha leituras a um genoma de referência estreitamente relacionado e, em seguida, constrói contigs e andaimes de novo.

Tabela 3. Os assembladores comuns para diversas plataformas de sequenciação.

Os utilizadores podem avaliar a qualidade das montagens de genomas em rascunho ou comparar montagens geradas por diferentes métodos. Existem uma variedade de métricas que refletem a qualidade da montagem. Apenas uma montagem contígua quase completa (aproximadamente 90%) interrompida por pequenas lacunas resultará numa anotação de genoma bem-sucedida.

• Tamanho do genoma. Tanto os métodos baseados no valor C como os baseados na frequência de k-mers podem inferir o tamanho do genoma.
• Contiguidade de montagem. A estatística N50 pode ser utilizada para avaliar a contiguidade da montagem, que descreve uma espécie de mediana dos comprimentos das sequências montadas.
• Precisão. Os dados do transcriptoma apresentam um recurso importante para validar a precisão das sequências e corrigir os scaffolds. Abordagens genómicas comparativas também podem fornecer orientação na deteção de montagens incorretas e contigs quiméricos.

Anotação do genoma

Para compreender plenamente a sequência do genoma, é necessário anotá-la com informações biologicamente relevantes, como termos de ontologia genética (GO), vias KEGG e modificações epigenéticas. A anotação envolve duas fases:

(1) Fase computacional. Uma fase computacional inclui a máscara de repetição, a predição da sequência codificadora (CDS) e a predição de modelos de genes.

• Máscara de repetições. Uma vez que as repetições são pouco conservadas entre espécies, recomenda-se criar uma biblioteca de repetições específica para a espécie utilizando ferramentas como RepeatModeler e RepeatExplorer.
• Previsão de CDS. Prever CDS utilizando algoritmos ab initio.
• Previsão de modelos de genes. O alinhamento de proteínas, transferências sinépticas de proteínas de outras espécies, EST e dados de RNA-seq podem fornecer um recurso valioso para prever modelos de genes.

(2) Fase de anotação. Todas as evidências mencionadas acima (previsão ab initio, bem como alinhamentos de proteínas, EST e RNA) são então sintetizadas numa anotação genética. Além disso, ferramentas de anotação automatizadas como o MAKER e o PASA estão disponíveis para integrar e ponderar as evidências. O WebApollo pode ser utilizado para editar a anotação através da interface visual se houver algo errado com as anotações genéticas.

Uma vez que a anotação do genoma é avaliada por inspeção visual, pode publicar as sequências de genoma em rascunho e a anotação. Para permitir que outros melhorem a montagem e a anotação do genoma, todos os dados brutos devem ser carregados. As bases de dados disponíveis para carregar genomas incluem o ENSEMBL e o NCBI.

Figura 2. Visão geral do fluxo de trabalho de bioinformática. (Bogaerts et al., 2021)

Outras análises avançadas

Aspectos adicionais dos resultados de sequenciação do genoma completo podem ser analisados, como a utilização de ferramentas como o Staramr para a identificação do genótipo genómico. Isto inclui a Tipagem de Sequência de Multilocais (MLST) e a Tipagem de Sequência de Multilocais do Genoma Central (cgMLST). Além disso, bases de dados como o ResFinder são empregues para a deteção de genes de resistência a antimicrobianos.

Ferramentas como o PlasmidFinder são utilizadas para detectar replicões de plasmídeos, analisando assim o tipo e a distribuição de plasmídeos. O uso do ABRicate, em conjunto com bases de dados de fatores de virulência (como o VFDB), facilita a deteção de genes associados à virulência bacteriana.

Softwares como o Roary são utilizados para construir o genoma central e o pan-genoma, enquanto ferramentas como o IQ-TREE assistem no desenvolvimento de árvores filogenéticas, ajudando a analisar as relações evolutivas entre estirpes. Para visualizar árvores filogenéticas e metadados, são implementadas ferramentas como o iTOL, que geram relatórios que são facilmente compreensíveis.

Se estiver interessado nos nossos serviços de genómica, por favor visite o nosso site: www.cd-genomics.com para mais informações. Podemos fornecer um pacote completo de sequenciação genómicaincluindo sequenciação do genoma completo, sequenciação do exoma completo, sequenciação de regiões alvo, sequenciação de DNA mitocondrial (mtDNA), e sequenciação completa de DNA plasmidial.

Referências:

1. Dolled-Filhart M P, Lee M, Ou-yang C, et al. Estruturas computacionais e de bioinformática para sequenciação de exoma e genoma de próxima geração. The Scientific World Journal, 2013, 2013.
2. Ekblom R, Wolf J B W. Um guia de campo para sequenciação de genoma completo, montagem e anotação. Aplicações evolutivas, 2014, 7(9): 1026-1042.
3. Kwong J C, McCallum N, Sintchenko V, et al. Sequenciação do genoma completo na microbiologia clínica e de saúde pública. Patologia, 2015, 47(3): 199-210.
4. Meena N, Mathur P, Medicherla K M, et al. Um Pipeline de Bioinformática para Sequenciação do Exoma Completo: Visão Geral do Processamento e Passos desde os Dados Brutos até a Análise Posterior. bioRxiv, 2017: 201145.
5. Oakeson K F, Wagner J M, Mendenhall M, et al. Análises bioinformáticas de dados de sequenciamento de genoma completo em um laboratório de saúde pública. Doenças infecciosas emergentes, 2017, 23(9): 1441.
6. Atxaerandio-Landa A, Arrieta-Gisasola A, Laorden L, et al. Um Fluxo de Trabalho de Bioinformática Prático para Análise Rotineira de Dados de WGS Bacteriano. Microorganismos. 29 de novembro de 2022;10(12):2364.
7. Bogaerts B, Nouws S, Verhaegen B, et al. Estratégia de validação de um fluxo de trabalho de sequenciação do genoma completo em bioinformática para Escherichia coli produtora de toxina Shiga utilizando uma coleção de referência extensivamente caracterizada com métodos convencionais. Genómica Microbiana, 2021, 7(3): 000531.
8. Bogaerts B, Delcourt T, Soetaert K, et al. Um Fluxo de Trabalho de Sequenciação de Genoma Completo em Bioinformática para Análise de Isolados Clínicos do Complexo Mycobacterium tuberculosis, Validado Usando uma Coleção de Referência Extensivamente Caracterizada com Métodos Convencionais e Abordagens In Silico. Revista de Microbiologia Clínica, 2021, 59(6): 10.1128/jcm. 00202-21.