Ligação de eccDNA à Instabilidade Genómica: alt-EJ, Stress de Replicação e Retrotransposões

Resumo e âmbito

Este guia avançado sintetiza como o DNA circular extracromossómico (eccDNA) emerge da instabilidade genómica e como pode persistir, reintegrar-se ou modular a função do genoma sob stress de replicação. Adotamos um equilíbrio cauteloso em relação à ideia de que os retrotransposões sequestram a alt-EJ para a replicação do DNA e a biogénese do eccDNA: apresentamos evidências de apoio, contra-exemplos e previsões testáveis, utilizando a embriogénese de Drosophila como âncora experimental principal. O conteúdo é apenas para uso em investigação.

Por que o eccDNA está no centro da instabilidade genómica

eccDNA é tanto um sintoma como um motor de instabilidade genómica. Eventos catastróficos como a cromotripeção, reparação propensa a erros através da junção de extremidades mediada por microhomologia (MMEJ, também chamada de alt-EJ) e stress de replicação podem gerar fragmentos circulares que variam desde microDNAs sub-quilobase até ecDNAs multi-megabase. Uma vez formados, esses círculos podem alterar a dosagem genética, titrar fatores de transcrição ou reinserir-se nos cromossomas para remodelar o genoma. Para uma discussão mais ampla sobre os efeitos patológicos subsequentes em modelos oncológicos, consulte a visão geral do eccDNA no câncer no recurso complementar. eccDNA no Cancro: Amplificação de Genes, Regulação de Oncogenes e Aplicações em Pesquisa.

Através dos sistemas, uma observação recorrente é a presença de microhomologia em junções circulares, sugestiva de atividade de alt-EJ/MMEJ, enquanto o stress nas forquilhas de replicação correlaciona-se com um aumento na produção de eccDNA e dinâmicas de destino alteradas. Mas quão forte é a cadeia causal, e onde se encaixam os retrotransposões? Esse é o foco deste guia.

Modelos de biogénese que deixam cicatrizes legíveis no genoma

Múltiplos mecanismos podem gerar eccDNA, e cada um tende a deixar assinaturas de sequência características que uma sequenciação e análise cuidadosas podem recuperar.

Reconhecemos pelo menos quatro rotas que são recorrentes na literatura. Primeiro, a cromotripsis produz muitos fragmentos após uma ou algumas rondas de quebra catastrófica; alguns fragmentos circularizam em vez de reintegrar. Segundo, os ciclos de quebra-fusão-ponte quebram e reúnem repetidamente cromossomos dicêntricos, criando ampliações e rearranjos complexos que podem gerar subprodutos circulares. Terceiro, a paragem da forquilha e a troca de molde criam junções com inserções templadas e microhomologia quando as forquilhas de replicação encontram barreiras. Quarto, a alt-EJ/MMEJ expõe microhomologias curtas por meio de ressecação e pode resolver segmentos loopados como eccDNA enquanto sela uma cicatriz de microhomologia no locus cromossómico.

O que deve esperar ver nos dados? Em bibliotecas de leituras curtas, verdadeiros junctions circulares aparecem como pares de leituras voltados para fora e leituras divididas que ligam o junction circular. Em leituras longas, o junction resolve-se como um concatémero cabeça-a-cauda ou um círculo de contig único com uma quebra abrupta, frequentemente mostrando microhomologia de 2–10 bp, pequenas inserções templateadas ou indels curtos. Estas assinaturas apontam coletivamente para vias de reanexação propensas a erros em vez da NHEJ clássica.

alt-EJ/MMEJ e a hipótese do alvo: retrotransposões sequestram alt-EJ para replicação de DNA e biogénese de eccDNA

MMEJ, frequentemente discutido de forma intercambiável com alt-EJ, baseia-se na resseção limitada em torno de uma quebra de dupla cadeia para revelar curtas secções de microhomologia. A polimerase theta (Polθ) pode estabilizar o emparelhamento e estender a partir da microhomologia alinhada, com a Ligase III e XRCC1 selando a junção final. Se a arquitetura da quebra contiver um segmento em laço ou um elemento repetitivo que forme uma aba durante o alinhamento, a aba pode ser excisada e circularizada como eccDNA.

Figura 1. Via MMEJ/alt‑EJ mediada por Polθ que produz eccDNA. A resecção das extremidades expõe pequenas saliências 3′ que são alinhadas através de microhomologias de 2–10 bp pela Polθ (atividades de helicase e polimerase); flaps ou segmentos em laço não emparelhados são excisados, lacunas são preenchidas e seladas pela polimerase Polθ e Ligase III/XRCC1, e o laço excisado pode circularizar como eccDNA, apresentando uma cicatriz de junção caracteristicamente flanqueada por microhomologia.

Instantâneo de evidências com fontes inline

Várias linhas de evidência conectam o uso de microhomologia à formação de eccDNA. Uma síntese de 2025 na Nucleic Acids Research argumentou que a MMEJ é uma via frequente para a formação de círculos, expondo tratos de microhomologia durante a resseção e ligando segmentos em laço como círculos; veja a revisão do mecanismo detalhado em Mecanismos moleculares da formação de DNA circular extrachromossómico — Nucleic Acids Research (2025) (DOI 10.1093/nar/gkaf122). De acordo com a discussão sobre cancro da NAR de 2024 sobre junções de eccDNA impulsionadas por microssatélites, a troca de molde associada à replicação ocorre frequentemente em conjunto com características de microhomologia nas junções circulares.Câncer NAR, 2024; DOI 10.1093/narcancer/zcae027). Em microssatélites desafiados na replicação, Gadgil et al. (2024) utilizaram PCR inversa e sequenciação para validar eccDNAs com inserções templadas e microhomologia de 2–10 bp, consistente com replicação induzida por quebras e cicatrizes semelhantes a MMEJ.DOI: Desculpe, mas não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça o texto que deseja traduzir.). Numa configuração engenheirada, a formação de círculos induzidos por CRISPR ocorre através de vias de reparo distintas com diferentes sensibilidades a inibidores, implicando contribuições tanto do NHEJ como do MMEJ dependendo do contexto, conforme mostrado na Cancer Discovery (2025; DOI: Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça-o e terei prazer em ajudar com a tradução.).

Interpretação

O peso das evidências apoia a envolvência da alt-EJ/MMEJ na formação de junções de eccDNA, especialmente sob stress de replicação, e particularmente perto de repetições onde a microhomologia é abundante. No entanto, a dependência universal da Polθ não está estabelecida em todos os sistemas. A microhomologia das junções é um forte indicador, mas não uma prova exclusiva, de MMEJ—alguns eventos de NHEJ ou de reparo templado podem imitar partes desta assinatura. Conclusões robustas requerem validação ortogonal e perturbações de via.

Retrotransposões, intermediários circulares e o que as evidências realmente mostram

A hipótese de interesse é frequentemente formulada de forma dramática: os retrotransposões sequestram a alt-EJ para a replicação do DNA e a biogénese de eccDNA. O que devemos fazer com isso?

Os elementos LTR geram cDNA através da transcrição reversa e dependem da integrase para inserção; os elementos não-LTR normalmente utilizam a transcrição reversa primada por alvo e geram intermediários de cDNA lineares. Alguns sistemas virais demonstram produtos LTR circulares (por exemplo, círculos de 2-LTR do HIV), mas os retrotransposões endógenos são uma questão diferente. Durante o envelhecimento da Drosophila, o eccDNA contendo sequências de elementos transponíveis acumula, especialmente quando o silenciamento de RNA é perturbado. Isto demonstra que sequências de TE aparecem em frações de DNA circular após enriquecimento com exonuclease e validação por PCR voltada para fora, conforme documentado por Yang et al., PLOS Genetics (2022) (DOI 10.1371/journal.pgen.1010024). Em contraste, os retrotransposões DIRS‑1 não LTR em Dictyostelium amplificam através de intermediários de cDNA linear e de cadeia simples em vez de círculos, o que argumenta contra um passo circular universal para elementos endógenos, como demonstrado em Godiska et al., Pesquisa em Ácidos Nucleicos (2020) (DOI 10.1093/nar/gkaa289).

Figura 2. Ciclo de vida dos retrotransposões e intermediários circulares em disputa — Os retrotransposões LTR podem produzir subprodutos circulares de um e dois LTR durante a transcrição reversa e recombinação intracromatídica, enquanto a evidência para intermediários circulares estáveis de elementos não LTR é mais fraca.

Síntese cautelosa

Padrões de suporte incluem a detectabilidade de sequências TE em pools de eccDNA em moscas, a microhomologia frequente em junções de eccDNA e fortes ligações entre o stress de replicação e a formação de círculos perto de repetições. Limites e lacunas persistem: o rastreamento molecular direto, específico de Drosophila, de intermediários de círculos LTR endógenos continua escasso; elementos não-LTR frequentemente favorecem intermediários lineares. Portanto, a frase retrotransposões sequestram alt-EJ para replicação de DNA e biogénese de eccDNA deve ser lida como um modelo testável e dependente do contexto, não como uma lei universal.

Para o manuseio computacional de círculos ricos em TE—incluindo mapeamento consciente de repetições, supressão de artefatos e reporte de junções—consulte o guia de bioinformática complementar focado em filtragem de repetições e normas.

• A filtragem computacional para elementos repetitivos é abordada na Bioinformática para eccDNA.

Estresse de replicação, cromotripse e destino dos círculos

O stress de replicação é um motor fiável de instabilidade genómica e correlaciona-se com o aumento da geração de eccDNA em múltiplos sistemas celulares. A hidroxicarbamida e a afidicolina perturbam a dinâmica de replicação e produzem paisagens distintas de alterações no número de cópias, micronúcleos e rearranjos em células humanas, conforme relatado em Nature Communications (2022) — stress de replicação e paisagens de número de cópias (DOI 10.1038/s41467-022-33485-4). Em paralelo, o trabalho com microssatélites demonstra que mecanismos associados à replicação podem gerar eccDNAs com cicatrizes de microhomologia, conforme mostrado por Gadgil et al., Nucleic Acids Research (2024) — eccDNA induzido por quebra de microsatélites (DOI 10.1093/nar/gkae417).

O que acontece aos círculos uma vez que se formam? Vários destinos são possíveis. Alguns círculos persistem como elementos autónomos que se segregam de forma desigual durante as divisões. Outros reintegram-se nos cromossomas, potencialmente formando regiões de coloração homogénea. Muitos provavelmente degradam-se ou diluem-se se não forem replicados ou selecionados.

Figura 3. Modelo de cromotripe: a destruição catastrófica dos cromossomas gera múltiplos fragmentos que podem ser religados, reintegrados em cromossomas ou circularizados para formar eccDNA/ecDNA; esses círculos podem persistir, ser perdidos ou reintegrar-se posteriormente, produzindo ampliações focais ou remodelação genómica.

A cromotripe adiciona outra camada. A fragmentação catastrófica cria numerosos fragmentos que podem ser religados em padrões complexos; alguns fragmentos circularizam-se em eccDNA ou ecDNA, enquanto outros reintegram-se. O sequenciamento de longas leituras de casos de cromotripe visualizou estas paisagens de rearranjo e apoia a plausibilidade da geração de círculos em tais contextos (veja o estudo de cromotripe de longas leituras emA sequenciação de leitura longa revela cromotripse em um caso molecularmente não resolvido da síndrome de Cornelia de Lange — Frontiers in Genetics (2024) (DOI: 10.3389/fgene.2024.1358334); DOI 10.3389/fgene.2024.1358334). Para uma discussão mais aprofundada sobre se os círculos podem manter o número de cópias de forma independente ou se reintegram principalmente para impulsionar ampliações, consulte o recurso complementar em Replicação Autônoma em eccDNA.

Síntese cautelosa

Há fortes evidências de que o stress de replicação eleva o rendimento de eccDNA e que tanto a reintegração como a manutenção autónoma podem ocorrer, dependendo do estado celular e das pressões seletivas. Qual destino domina é dependente do contexto. Desentrelaçar estes fatores experimentalmente requer leituras ortogonais: montagens de leituras longas, imagiologia citogenética e enriquecimento específico de círculos, além da validação de junções.

Embriogénese de Drosophila como um campo de teste para mecanismo e medição

A embriogénese inicial de Drosophila apresenta fases S extraordinariamente rápidas com fases de intervalo mínimas, tornando o stress de replicação inerentemente provável em loci repetitivos. O genoma contém diversos elementos LTR e não LTR, microssatélites e repetições em tandem—um terreno fértil para a troca de molde e reparo mediado por microhomologia. O sistema é geneticamente manipulável, permitindo perturbações nas vias dos componentes Polθ/TMEJ e estressores de pequenas moléculas. Embora os relatos diretos de HU ou apidicolina a induzirem eccDNA em embriões sejam limitados, evidências de outros sistemas e de moscas adultas/envelhecidas justificam o uso de embriões como um modelo rigoroso e testável.

Um experimento reproduzível pode ser organizado em etapas. Primeiro, colete e estagie embriões de 0 a 2 horas, deschorione e concentre-se nos ciclos pré-celularização onde as fases S são rápidas. Mantenha janelas de tempo rigorosas para limitar a variabilidade do desenvolvimento. Em segundo lugar, titule a exposição a hidroxureia ou apidicolina em embriões permeabilizados ou células embrionárias cultivadas para introduzir perturbações na forquilha sem causar letalidade; controles paralelos com veículo são obrigatórios. Em terceiro lugar, extraia DNA e enriqueça para círculos usando digestão com exonuclease, adicionando padrões circulares para quantificar a eficiência de enriquecimento. Se a entrada for limitada, utilize amplificação em círculo rolante ou preparação de biblioteca estilo Circle-Seq. Em quarto lugar, prepare tanto bibliotecas de leitura curta da Illumina quanto bibliotecas de leitura longa de nanopore; enriqueça para leituras voltadas para fora sempre que possível, e para leituras longas, tenha como alvo um N50 suficiente para abranger os círculos esperados. Finalmente, valide junções via PCR inversa e Sequenciação de Sanger e, se desejado, qPCR específico para junções para quantificação ao longo dos pontos de tempo ou genótipos.

Os controlos devem incluir embriões tratados de forma simulada, bibliotecas sem exonuclease para estimar o fundo, e controlos de enzimas inativadas por calor. Os controlos positivos podem incluir tecidos adultos conhecidos por acumular TE‑eccDNA com a idade e inserções de plasmídeos para verificar o enriquecimento e a recuperação da biblioteca. Perturbações genéticas, como a perda de função de Polθ ou a depleção de Ligase III/XRCC1, ajudam a testar as contribuições do MMEJ, enquanto perturbações de DNA‑PKcs ou ATM investigam a participação do NHEJ/HR. As assinaturas esperadas incluem um enriquecimento de junções circulares com 2–10 bp de microhomologia, pequenas inserções templadas, círculos de mapeamento de TE aumentados sob stress, alterações nas distribuições de tamanhos de círculos e círculos próximos a genes perto de repetições desafiadas pela replicação.

Divulgação e exemplo neutro de apoio à externalização

Divulgação: CD Genomics é o nosso produto. Na prática, equipas sem preparação de biblioteca interna ou capacidade de leitura longa às vezes subcontratam o enriquecimento em círculo e a sequenciação a um fornecedor para acelerar a iteração. Por exemplo, os investigadores podem usar o fluxo de trabalho de sequenciação de eccDNA (DNA circular) para combinar o enriquecimento baseado em exonuclease com plataformas de leitura curta e longa, e depois validar os junctions selecionados com PCR e Sanger. Consulte a visão geral do serviço não clínico na página de serviço de sequenciação de eccDNA da CD Genomics para uma descrição dos inputs típicos, métricas de QC e entregáveis.

• Visão geral do fluxo de trabalho em Serviço de Sequenciação de eccDNA.

Bioinformática e normas de reporte para círculos ricos em repetições

A mapeamento consciente de repetições e o controlo de artefatos são a espinha dorsal de chamadas credíveis de eccDNA, especialmente quando elementos transponíveis ou microsatélites estão envolvidos. Um pipeline prático de dois caminhos funciona bem. Do lado das leituras curtas, utilize chamadores conscientes de círculos, como Circle-Map, AA, ou estruturas integradas como eccDNA-pipe, que requerem leituras divididas e pares orientados para fora que abrangem a junção e uma cuidadosa desduplicação para gerir artefatos de PCR. Do lado das leituras longas, mapeie com minimap2 usando parâmetros ajustados para repetições, assemble círculos suspeitos quando a cobertura permitir, valide a estrutura cabeça-a-cauda e calcule a cobertura por círculo em relação às regiões flanqueadoras. Para cada junção, reporte o comprimento e a sequência da microhomologia, quaisquer inserções templadas e tamanhos de indel; registe as coordenadas mais à esquerda e os deslocamentos para representar alinhamentos ambíguos em contextos repetitivos. Filtros de artefatos devem remover junções explicadas por produtos de PCR quiméricos, artefatos de ligadura ou transbordamento de mapeamento através de repetições altamente semelhantes; spike-ins e leituras simuladas ajudam a avaliar falsos positivos.

Um template de relatório mínimo deve incluir metadados de amostra e condição (regime de stress e estágio), métricas de enriquecimento (fração de DNA linear removido; recuperação de spike-ins circulares), uma tabela de junções (coordenadas, microhomologia, suporte de leitura, anotação de TE, tamanho, estado de validação) e métricas de reprodutibilidade (sobreposição entre réplicas e correlações de abundância; sensibilidade em relação a spike-ins). Para uma revisão metodológica e ferramentas consolidadas, veja eccDNA‑pipe, Briefings in Bioinformática (2024).

Questões em aberto e previsões testáveis em moscas

Dada a evidência atual, vários experimentos poderiam aprimorar a compreensão. A perda de Polθ reduz o eccDNA contendo TE especificamente sob estresse de replicação em embriões? Uma queda nas junções ricas em microhomologia juntamente com uma mudança em direção a junções semelhantes a NHEJ apoiaria as contribuições do MMEJ. Os círculos de retrotransposões LTR são diretamente observáveis como leituras longas discretas de cabeça a cauda em embriões, ou os TE-eccDNAs refletem em grande parte subprodutos da reparação em repetições flanqueadoras de TE? O enriquecimento de junções LTR–LTR apoiaria verdadeiros círculos; o enriquecimento de junções TE–repetições do hospedeiro favoreceria subprodutos de reparação. O estresse de replicação aumenta a razão de persistência de eccDNA versus reintegração em linhagens embrionárias? Curso temporal. sequenciação de leitura longa e a imagiologia poderia revelar segregação desigual (persistência semelhante à autónoma) versus regiões com coloração homogénea (reintegração). Finalmente, será que a troca de templados e assinaturas semelhantes ao FoSTeS podem ser separadas de forma clara das cicatrizes MMEJ em microsatélites embrionários? A presença de inserções templadas que abrangem templados não adjacentes apoiaria as contribuições do FoSTeS/MMBIR.

Estes experimentos podem ser executados em Drosophila com uma cuidadosa organização, perturbações de vias e sequenciação moderna consciente de círculos, proporcionando um teste rigoroso de quando e como os retrotransposões parecem envolver a maquinaria alt-EJ/MMEJ.

Colocando a hipótese em perspectiva

A frase retrotransposões sequestram a alt-EJ para replicação de DNA e biogénese de eccDNA captura um modelo unificador apelativo. As evidências a favor incluem a acumulação de TE‑eccDNA em moscas, o uso de microhomologia em muitos pontos de junção de círculos, e fortes ligações entre o stress de replicação e a formação de círculos perto de repetições. Os contra-argumentos incluem intermediários lineares estabelecidos para certos elementos não-LTR e a possibilidade de que muitos TE‑eccDNAs sejam subprodutos de reparação em vez de intermediários circulares funcionais no ciclo de vida de um retrotransposão. Em balanço, a afirmação deve ser tratada como uma hipótese testável dependente do contexto que deve ser avaliada locus a locus e sistema a sistema.

Uma opção de encerramento amigável para RUO

Se precisar de capacidade adicional para sequenciação enriquecida em círculo ou validação independente de junções enquanto avalia estes mecanismos, um fornecedor para uso em investigação pode ajudar com métricas e entregas de QC padronizadas, para que possa concentrar-se nas variáveis experimentais. Consulte o link do exemplo anterior para um esboço dos inputs e outputs típicos de sequenciação.

Autor

Yang H. — Cientista Sénior, CD Genomics; Universidade da Florida.

Yang é um investigador em genómica com mais de 10 anos de experiência em investigação em genética, biologia molecular e celular, fluxos de trabalho de sequenciação e análise bioinformática. Habilidoso tanto em técnicas de laboratório como na interpretação de dados, Yang apoia o design de estudos RUO e projetos baseados em NGS.

Referências:

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