Estresse de Replicação e eccDNA: Hidroxiureia, Efeitos do Ciclo Celular e Considerações sobre o Desenho do Estudo

O pequeno DNA circular extracromossómico (eccDNA) é um subproduto adaptável—e, por vezes, um impulsionador—da plasticidade do genoma. O stress de replicação amplifica as condições sob as quais fragmentos de DNA podem ser excisados e ligados em círculos. A hidroxicarbamida (HU), um inibidor bem caracterizado da ribonucleotídeo redutase, fornece um modelo controlável para induzir stress de replicação em cultura celular. Este tutorial avançado explica como as bifurcações paradas induzidas por HU contribuem para a formação de eccDNA, o que esperar ao longo do ciclo celular e como desenhar experiências que resultem em medições interpretáveis e reproduzíveis—estritamente para uso em investigação apenas (RUO).

Focamos no mecanismo central: a paragem e colapso da forquilha na fase S sob a depleção de pools de dNTP por HU, que pode impulsionar a excisão por loop-out e a junção de extremidades mediada por microhomologia (MMEJ/alt-EJ) para formar círculos. Em seguida, traduzimos esta perspetiva mecanicista em passos práticos para seleção de dose-tempo, janelas de amostragem, enriquecimento e construção de bibliotecas para amostras estressadas de baixo input, controlos de artefactos e padrões de reporte em bioinformática. Ao longo do texto, destacamos onde um controlo de qualidade rigoroso previne confusões causadas por apoptose e DNA mitocondrial.

Por que o stress de replicação é um catalisador para a plasticidade do genoma

O stress de replicação refere-se a condições que diminuem, interrompem ou colapsam as forquilhas de replicação do DNA—comumente através da depleção de pools de nucleotídeos, impedimentos da polimerase ou desacoplamento helicase–polimerase. A HU inibe principalmente a ribonucleotídeo redutase (RNR), limitando a conversão de NDPs em dNDPs e reduzindo os pools de dNTPs necessários para a progressão da polimerase. As forquilhas paradas acumulam DNA de cadeia simples (ssDNA), recrutam RPA e ativam os pontos de verificação ATR–Chk1; a ativação da origem é suprimida, e as células tentam estabilizar e reiniciar as forquilhas. Sob stress sustentado, algumas forquilhas colapsam, produzindo quebras de dupla cadeia de extremidade única que devem ser processadas e reparadas.

Neste cenário, o eccDNA pode emergir. A excisão em loop de pequenos segmentos genómicos seguida de ligadura em círculos é favorecida quando a resseção expõe microhomologias e a junção de extremidades alternativa (MMEJ/TMEJ) opera de forma robusta—condições prevalentes em S e G2. Em essência, "eccdna de stress de replicação" captura como as perturbações da forquilha alteram o processamento de quebras e a escolha de vias, inclinando-se para a circularização em certos contextos de sequência (por exemplo, repetições) e configurações de reparo.

Mecanicamente, a HU tem dois efeitos interligados: a depleção de dNTPs através da inibição da RNR e, a algumas doses, espécies reativas de oxigénio (ROS) que oxidam os clusters de Fe–S nas polimerases replicativas, promovendo a dissociação da polimerase mesmo quando os pools de nucleotídeos são parcialmente adequados. Juntos, estes fatores empurram as forquilhas para estados instáveis, preparados para colapsar e para uma reparação propensa a erros.

Hidroxicarbamida como um modelo de stress de replicação: mecanismo e limites de dosagem

A hidroxicarbamida é amplamente utilizada para criar stress de replicação controlado. Ela para as forquilhas ao esgotar os dNTPs e pode gerar ROS que afetam a função da polimerase. O mecanismo duplo aumenta a probabilidade de desacoplamento entre helicase e polimerase, exposição de ssDNA e ativação de pontos de controlo.

Para usar HU de forma eficaz, distinga "stress" de "toxicidade". Você quer assinaturas de checkpoint robustas (p-CHK1, focos de γH2AX; incorporação reduzida de EdU) com apoptose mínima (baixo Annexin V/PI e PARP clivado) na colheita. Titulações piloto são indispensáveis porque a sensibilidade difere entre linhas celulares e células primárias.

Diretrizes práticas para modelos celulares (não prescritivas; ajustar por linha após pilotos) são melhor implementadas como um plano narrativo em vez de uma lista de verificação. Comece por definir um paradigma de pulso agudo em HeLa ou U2OS: exponha as células a 0,5–1 mM de HU durante 2–4 horas para induzir uma paragem clara sem morte generalizada, depois liberte-as em meio fresco e amostre as janelas de S/G2 tardias. Em paralelo, considere um paradigma crónico de baixa dose (cerca de 0,2 mM de HU durante vários dias) se estiver a investigar efeitos de contexto de sequência, como círculos associados a microssatélites; este regime perturba a progressão da polimerase e a ativação de origens de forma subtil, com impactos distintos na estrutura do círculo.

À medida que aumenta a dose ou prolonga o tempo, monitore o equilíbrio entre o envolvimento do ponto de verificação e a apoptose. Um pulso moderado a 1 mM durante quatro horas produzirá uma ativação mais forte de ATR–Chk1 e mais focos de γH2AX do que um pulso a 0,5 mM, mas a viabilidade deve permanecer alta em linhas competentes para o ponto de verificação. Em contraste, prolongar 1–2 mM de HU durante 16–24 horas pode inclinar a resposta para a apoptose em alguns contextos genéticos, confundindo as leituras de eccDNA com fragmentos apoptóticos. Os fibroblastos primários frequentemente exigem condições mais suaves—explore 0,2–0,5 mM durante 2–6 horas, confirme marcadores de estresse e só então prolongue as exposições.

Os pontos de controlo e as leituras de viabilidade ancoram estas decisões. Realize pulsos de EdU e meça a incorporação para confirmar a desaceleração da síntese de DNA; quantifique os focos de γH2AX como um proxy para o colapso da forquilha e quebras de dupla cadeia (DSBs); faça blot para p-CHK1 para confirmar a ativação do ponto de controlo. Nas mesmas amostras, exclua as condições com alta Annexina V/PI ou PARP clivada. Finalmente, perfil de conteúdo de DNA por citometria de fluxo (PI ou DAPI) para documentar %G1/S/G2 na colheita e durante a recuperação.

Figura 1: Mecanismo de forquilhas paradas por HU e circularização em laço.

Legenda: Esquema mostrando HU (RNR↓) induzindo paragem e colapso da forquilha, resseção expondo microhomologias, e excisão e ligação mediadas por MMEJ/TMEJ em eccDNA. Destinam-se a notar destinos alternativos (reinserção, micronúcleos). Esta figura ilustra o conceito central de "eccDNA de stress de replicação".

Contexto do ciclo celular: formação na fase S e persistência na fase G2

Os círculos formam-se em S? Sim—A fase S fornece o substrato (replicação ativa, ssDNA emergente, resecção) e o ambiente enzimático onde as vias alternativas de junção de extremidades operam em conjunto com a recombinação homóloga. À medida que as forquilhas estagnam ou colapsam, pequenos segmentos podem ser excisados e circularizados. Persistem na G2? Muitas vezes, sim. Os círculos podem permanecer detectáveis durante a G2 e segregar na mitose, com as células filhas herdando eccDNA enquanto as deleções cromossómicas correspondentes persistem ou são reparadas.

A implicação prática é que as janelas de sincronização e amostragem determinam o que você mede. Se você coletar no final do tratamento com HU, enriquece círculos de late-S associados a uma paragem aguda. Se você amostrar 6–24 horas após a libertação, captura a fase de persistência em G2/M e o potencial declínio em direção a G1. O bloqueio com dupla timidina ajuda a enriquecer uma coorte que entra em S de forma uniforme, enquanto a sincronização com HU (paragem forte e temporária no início de S) seguida de libertação permite acompanhar uma onda condicionada por stress através de S e até G2. Verifique sempre as frações por citometria de fluxo e sobreponha os dados de pulso de EdU para confirmar a replicação ativa durante as suas janelas de amostragem.

Compreender os mecanismos da biogénese ajuda a interpretar isto—veja o contexto mecanicista detalhado em Ligação de eccDNA à Instabilidade Genómica: alt‑EJ, Stress de Replicação e Retrotransposões: Mecanismos que ligam o stress de replicação e o eccDNA.

Imagem 2: Perfis de citometria de fluxo sob HU

Legenda: Histograma de citometria de fluxo conceptual comparando o conteúdo de DNA em células de controlo vs células tratadas com HU. O HU aumenta a fração na fase S inicial e suprime a progressão; as janelas de recuperação mostram a reintegração na fase S tardia/G2. Utilize esta leitura para alinhar a amostragem de eccDNA com o estado do ciclo celular.

Estresse de replicação eccDNA: do mecanismo à medição

Colocando a frase exata em destaque, "stress de replicação eccdna" descreve um resultado mensurável da perturbação da forquilha. Não se trata apenas de mais círculos; trata-se de quais círculos se formam, onde ocorrem as junções e como a escolha da via de reparo e o contexto da sequência moldam o espectro que você detecta. Em regiões densas em repetições, a microhomologia pode servir de suporte para a excisão em laço. Sob estresse crónico baixo, as estruturas circulares podem diversificar-se sem necessariamente produzir um aumento acentuado no total de contagens. Sob pulsos agudos mais fortes, pode-se observar um aumento transitório nas junções consistente com a quebra da forquilha e a junção de extremidades templadas.

Projetar o seu ensaio para capturar esta nuance significa escolher condições de dose-tempo que elicitem stress verificado por pontos de controlo, enquanto preservam a viabilidade, amostrando durante a recuperação das fases S e G2, e reportando evidências a nível de junção em vez de apenas contagens globais.

Desenho do estudo: um plano narrativo para medições de eccDNA interpretáveis

Um estudo robusto não depende de uma única lista de verificação; integra seleção de modelo, dosagem, sincronização, amostragem, controlos, enriquecimento, verificação e análise. Aqui está como isso normalmente se desenrola.

Comece com uma hipótese ancorada no contexto da sequência ou na dependência do caminho. Se estiver a testar se os microsatélites produzem círculos preferencialmente sob stress, favoreça um regime crónico de baixa dose (cerca de 0,2 mM HU durante vários dias) e inclua um braço de aphidicolina, pois um estressor que impede a polimerase pode servir como uma confirmação ortogonal. Se estiver a mapear a colapso agudo da forquilha e as trajetórias de reparo, desenhe pulsos de 0,5–1 mM HU durante 2–4 horas e planeie uma série de recuperação para capturar a formação tardia de S e a persistência de G2.

Sincronize os seus coortes. O bloqueio com dupla timidina produz uma entrada relativamente uniforme na fase S; a sincronização com HU interrompe a fase S inicial e cria uma onda na libertação. Escolha a abordagem que melhor se adequa aos seus objetivos e que a sua linha celular tolera bem. Verifique a sincronização e a progressão através de citometria de fluxo e pulsos de EdU.

Os controlos mantêm a sua interpretação honesta. Linhas de base não tratadas fornecem uma referência para contagens de círculos e motivos de junção em células não stressadas. Um braço de afidicolina permite confirmar que fenómenos específicos de stress de replicação ocorrem quando as polimerases são desaceleradas por um agente diferente. Se o componente ROS do HU for suspeito nas suas doses, introduza pré-tratamentos antioxidantes com cautela para testar se as assinaturas de círculos mudam quando as contribuições oxidativas são mitigadas. Onde permitido, sondas de via—inibição de POLQ (MMEJ/TMEJ) versus inibição de DNA-PKcs (c-NHEJ)—podem ajudar a confirmar a dependência da junção mediada por microhomologia.

Planeie o enriquecimento e a preparação da biblioteca para baixo input. Células stressadas produzem menos ADN e círculos mais frágeis. A digestão com exonuclease (nuclease dependente de ATP) remove ADN linear; verifique a digestão com ensaios de qPCR direcionados a loci lineares. A amplificação em círculo rolante (Phi29) aumenta a sensibilidade a pequenos círculos, mas introduz viés; equilibre a RCA com etapas sem PCR para círculos maiores, sempre que possível. Painéis de captura híbrida direcionados a repetições ou loci de interesse podem aumentar o sinal em contextos de baixo input, e a confirmação de leituras longas para amostras selecionadas desambiguará junções ricas em repetições.

Assegure-se de que a preparação da sua biblioteca acomoda entradas baixas—consulte as orientações detalhadas em Fluxo de Trabalho Experimental para Sequenciação de eccDNA: Enriquecimento, preparação de biblioteca e armadilhas comuns.

A verificação e o controlo de qualidade são a espinha dorsal da reprodutibilidade. Confirme o stress de replicação (EdU, γH2AX, blot de pontos de controlo) e exclua a apoptose (Annexina V/PI, PARP clivado). Valide as estruturas de eccDNA com PCR inversa através de junções e PCR com primers divergentes; quando disponível, corrobore as junções utilizando dados de leitura longa. Acompanhe as leituras mitocondriais separadamente e filtre de forma robusta — os círculos de mtDNA são um fator de confusão comum em bibliotecas enriquecidas. O controlo de qualidade é crítico ao lidar com amostras stressadas — veja: Métricas de Qualidade para Sequenciação de eccDNA.

Adicione rigor logístico. Alinhe os seus fluxos de trabalho de amostragem e submissão com os inputs documentados e os limiares de QC. Se for subcontratar sequenciação ou análise, reveja as Diretrizes de Submissão de Amostras para garantir que o tampão, volume, concentração e condições de envio protejam a integridade circular: Diretrizes para Submissão de Amostras.

Bioinformática e relatórios: parâmetros concretos e exemplos

A análise começa com dados limpos e limiares transparentes. Para bibliotecas Illumina enriquecidas para círculos, o corte de adaptadores (por exemplo, Trim Galore ou fastp) deve ser seguido pelo mapeamento com consciência de leituras divididas. O Bowtie2 em modo de ponta a ponta ou o BWA-MEM podem ser configurados para capturar alinhamentos com clipes suaves; muitas ferramentas de eccDNA envolvem esses mapeadores e extraem candidatos a junções.

Um exemplo de pipeline de leitura curta da Illumina pode ser assim:

• Controlo de qualidade: executar FastQC e MultiQC; garantir que a qualidade por base > Q30 para a maioria das leituras; documentar duplicação e conteúdo de GC.
• Corte: fastp com deteção automática de adaptadores; cortar para remover bases finais de baixa qualidade (—cut_right) enquanto se evita o corte excessivo que perturba os sinais de junção.
• Mapeamento: BWA‑MEM com semeadura padrão, reportando alinhamentos secundários; permitir clips suaves para expor sequências de junção.
• Chamada de junção: uma ferramenta como ecc_finder ou Circle-Map agrega leituras divididas e pares discordantes; defina o suporte mínimo para ≥4 leituras divididas mais ≥4 pares discordantes por junção, e exija ≥99% de cobertura da sequência do círculo em bibliotecas enriquecidas.
• Repetir anotação: interseccionar junções e círculos com faixas do RepeatMasker/Dfam; sinalizar chamadas densas de repetições e exigir evidência mais forte ou validação ortogonal.
• Filtragem mitocondrial: excluir ou reportar separadamente os círculos derivados de mtDNA; se o mtDNA dominar, rever as definições de enriquecimento e RCA.
• Distribuição de tamanhos e contexto genómico: relatar a mediana e os intervalos interquartis para os tamanhos dos círculos; anotar a proximidade a genes, potenciadores ou famílias de repetições.
• Profundidade e normalização: indique as contagens de leitura por amostra; normalize as contagens pelo número de células ou pelo DNA nuclear de entrada; inclua estimativas de recuperação de spike-in, se utilizadas.

Para leitura longa validação de bibliotecas enriquecidas, a ênfase muda para a continuidade e confirmação de junções. Mapear com minimap2 usando parâmetros ajustados para templates circulares (—secondary=no para reduzir o ruído de múltiplas mapeações em repetições, com cuidadosa consideração para duplicados verdadeiros). Exigir leituras que atravessem a junção com alta identidade e confirmar sequências de junção consensuais. Reportar contagens de leituras por círculo e cobertura, e, quando viável, partilhar sequências de junção representativas.

A transparência na reportação fortalece a interpretação. Inclua o mapeador e a versão, parâmetros, suporte mínimo de junção, estratégia de filtragem de repetições, tratamento mitocondrial, profundidades por amostra e opções de normalização. Para suporte à análise posterior, consulte a CD Genomics. Serviços de BioinformáticaPara planear a cobertura de forma realista, defina os objetivos com o explicador: Profundidade de Sequenciamento e Cobertura.

Disponibilidade de dados (RUO)

Exemplos públicos que podem ser usados para reproduzir chamadas em círculo e pipelines de análise incluem o acesso GEO. GSE261856 (Circle‑seq de células estaminais mesenquimatosas da medula óssea humana; Circle‑seq de leitura curta; veja a página de aterragem do GEO) e GSE165919 (eccDNA de comprimento total amplificado por círculo rolante perfilado pela Oxford Nanopore; consulte a página de aterragem do GEO). Como referência de métodos, veja os dados ATAC‑eccDNA de Kumar et al., Sci Adv (2020) DOI:10.1126/sciadv.aba2489. Parâmetros de análise mínimos para reprodutibilidade: mapeador (BWA‑MEM ou minimap2), suporte mínimo de junção ≥4 leituras divididas mais ≥4 pares discordantes, e filtragem mitocondrial explícita. Se disponível, inclua MD5s de acesso ou versões de arquivo para replicação exata.

Resolução de Problemas: artefatos e leituras incorretas, tratados em prosa

Os fragmentos apoptóticos são o confusor mais comum. Se a positividade para Annexina V/PI aumentar, as suas contagens de "eccDNA" podem inflacionar devido a DNA linear fragmentado que sobreviveu à digestão ou que foi ligado em círculos após a lise. Aperte o portão de viabilidade, reduza a exposição e colete mais cedo na recuperação. Verifique a eficiência da digestão por qPCR contra loci lineares e considere um segundo passo de digestão com cofactor ATP fresco.

O DNA linear residual pode sobreviver ao tratamento com exonucleases quando os cofatores estão esgotados ou os tampões estão fora do ideal. Reotimize as condições da nuclease, verifique a frescura dos reagentes e inclua pré-limpezas com enzimas de restrição que visem contaminantes lineares conhecidos (por exemplo, plasmídeos) antes da exonuclease.

A dominância mitocondrial em bibliotecas enriquecidas é um problema amplamente reportado. Minimize o viés da RCA em relação a círculos pequenos ajustando os tempos e temperaturas de reação, e filtre as leituras mitocondriais rigorosamente durante a análise. Em alguns contextos, a pré-limpeza das mitocôndrias antes da extração ajuda, mas avalie o risco para os círculos nucleares.

Os falsos positivos ricos em repetições surgem quando as leituras se mapeiam de forma ambígua entre elementos em tandem. Aumente os limiares de suporte de junção, anote as repetições de forma abrangente e exija confirmação ortogonal (iPCR ou junções de leituras longas) para chamadas de alto impacto. Pense nas repetições como espelhos acústicos: elas refletem as leituras; o seu pipeline precisa de sinal suficiente para separar o eco da fonte.

Baixo rendimento de biblioteca em amostras stressadas é mais logística do que teoria. Agrupe replicados biológicos, utilize adaptadores e kits de baixo input validados para entradas em nível de nanograma, e mantenha a lise suave para preservar a integridade circular. Se a RCA se tornar demasiado enviesada, mude para captura híbrida para loci de interesse e adicione confirmação de leitura longa para junções que permaneçam ambíguas.

Imagem 3: Variação conceptual do eccDNA em função da dose e recuperação

Legenda: Esquema, não dados empíricos. Doses moderadas de HU e janelas de recuperação precoces (final da fase S–G2) frequentemente resultam nos maiores contagens mensuráveis de eccDNA, com declínios à medida que as células retornam à fase G1.

Considerações sobre enriquecimento e biblioteca para células em stress

Escolher a estratégia de enriquecimento certa é essencial para a reprodutibilidade. A digestão com exonuclease remove DNA linear; verifique com qPCR e evite a sobre-digestão que pode degradar círculos frágeis. A amplificação em círculo rolante (Phi29) é sensível a círculos pequenos, mas pode enviesar a representação; combine RCA com etapas sem PCR para círculos maiores sempre que possível. A captura direcionada pode aumentar o sinal em contextos de baixo input, e a validação com leituras longas desambigua junções ricas em repetições.

Exemplo prático de fluxo de trabalho (RUO)

Para fundamentar os passos acima, aqui está um fluxo de trabalho neutro e exemplificativo que um investigador principal (PI) pode adotar num modelo HeLa ou U2OS.

Objetivo: Medir a formação de eccDNA sob stress de replicação induzido por HU, focando na formação na fase S e na persistência na fase G2. Projetar braços de HU a 0,5 mM durante duas horas (agudo), 1 mM durante quatro horas (agudo mais forte) e 0,2 mM durante quatro dias (crónico). Incluir um braço de afidicolina (0,2 µM, dois dias) como um estressor ortogonal. Amostrar no final do tratamento e a 6, 24 e 48 horas após a libertação.

A verificação deve mostrar uma queda na incorporação de EdU, focos de γH2AX e negatividade para Annexin V/PI na colheita. O enriquecimento prossegue com digestão exonucleolítica para remover DNA linear e RCA para pequenos círculos; as junções são validadas por PCR inversa. O sequenciamento na Illumina visa 30–50 milhões de leituras por amostra para bibliotecas enriquecidas, com validação de leituras longas para um subconjunto para confirmar a continuidade das junções. A análise utiliza evidências de leituras divididas e pares discordantes para identificar círculos, reporta o suporte das junções e distribuições de tamanho, anota o conteúdo repetido e filtra mtDNA de forma robusta.

Para suporte de sequenciação e análise posterior, a CD Genomics' Sequenciação de Nova Geração e Serviços de Bioinformática pode ser utilizado em estudos RUO para processar bibliotecas de eccDNA e gerar relatórios padrão. Divulgação: CD Genomics é o nosso produto. Se planeia submeter amostras, reveja o Diretrizes para Submissão de Amostras para alinhar volumes, buffers e QC com requisitos de baixo input.

Conclusão e próximos passos

Modelos de stress como o HU revelam regras de formação de eccDNA: as forquilhas da fase S estão preparadas para excisão em loop-out e ligadura mediada por MMEJ, os círculos podem persistir na fase G2, e a abundância medida depende fortemente das escolhas de dose-tempo e das janelas de amostragem. Os estudos mais interpretáveis separam o stress de replicação da toxicidade, sincronizam e verificam os estados do ciclo celular, implementam enriquecimento e preparação de biblioteca conscientes de baixo input, e aplicam bioinformática resistente a artefatos com relatórios transparentes.

Para capturar eventos transitórios de forma eficaz, escolha os métodos de enriquecimento adequados: digestão com exonuclease, RCA, captura e controlos. E lembre-se—os métricas de qualidade determinam a confiança ao lidar com amostras stressadas.

Finalmente, uma frase que pode encontrar em pesquisas é "eccdna e hidroxicarbamida." Embora seja um erro de ortografia de hidroxicarbamida, a intenção é a mesma: explorar o eccDNA sob stress de replicação induzido por HU.

Autor

Yang H. — Cientista Sénior, CD Genomics; Universidade da Florida.

Yang é um investigador em genómica com mais de 10 anos de experiência em investigação em genética, biologia molecular e celular, fluxos de trabalho de sequenciação e análise bioinformática. Habilidoso tanto em técnicas de laboratório como na interpretação de dados, Yang apoia o design de estudos RUO e projetos baseados em NGS.

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