O Desafio e o Fluxo de Trabalho do Sequenciamento de RNA Pequeno

O que é o sequenciamento de RNA pequeno?

Sequenciação de pequenos RNAs (Small RNA-Seq), facilitado por Sequenciação de Nova Geração (NGS) A tecnologia é uma técnica instrumental para a isolação e aquisição de informações sobre moléculas de RNA não codificante. Este método permite a distinção e avaliação de pequenos RNAs, incluindo a descoberta de variantes novas e a previsão das suas funções potenciais. Ao capitalizar sobre tal tecnologia, os pequenos RNAs podem ser diferenciados de famílias de RNA maiores, melhorando assim a nossa compreensão dos seus papéis nas funções celulares e na expressão génica.

Sequenciação de RNA pequeno representa uma abordagem cada vez mais popular para abordar as questões biológicas dos miARNs e outros pequenos ARN não codificantes (sncARNs), como os ARN piwi-interactantes (piARNs), ARN pequenos interferentes (siARNs) e ARN de iniciação da transcrição (tiARNs). Os miARNs, piARNs e siARNs são os três sncARNs mais focados e são amplamente estudados através de sequenciação, uma vez que foi relatado que desempenham um papel vital na regulação pós-traducional da expressão génica. A sequenciação de pequenos ARN tornou-se um bom padrão tanto para a descoberta de pequenos ARN quanto para o perfilamento de pequenos ARN, uma vez que podem sequenciar todo o complemento de pequenos ARN com alta taxa de transferência e alta sensibilidade. Comparado com microarrays e qPCR, sequenciação de RNA pequeno não requer conhecimento a priori da sequência. Além da aquisição da gama completa de espécies de miRNA e pequenas RNAs, sequenciação de pequenos RNAs também ajuda a entender como a regulação pós-transcricional afeta o fenótipo e a identificar novos biomarcadoresTem sido amplamente aplicado na investigação do câncer e de doenças complexas.

Os pequenos RNAs constituem uma grande categoria de moléculas reguladoras, incluindo miRNA, ncRNA, siRNA, snoRNA, piRNA e rasiRNA, que são encontrados de forma ubíqua em todas as entidades biológicas. Estes pequenos RNAs regulam o crescimento, desenvolvimento e progressão de doenças dos organismos através de vários meios, como degradação de mRNA, repressão da tradução, formação de heterocromatina e eliminação de DNA. O sequenciamento de pequenos RNAs (sRNA), geralmente realizado na plataforma Illumina HiSeq, facilita a análise abrangente de miRNAs, siRNAs e piRNAs presentes nas amostras. Além disso, esta tecnologia pode identificar sRNAs conhecidos, prever novos e antecipar genes-alvo de sRNA, fornecendo assim uma ferramenta poderosa para examinar a funcionalidade dos pequenos RNAs e os mecanismos regulatórios.

Figura 1. A estrutura e classificação dos pequenos RNAs. (Xiong et al., 2023)

Vantagens da Sequenciação de Pequenos RNAs

Sequenciação de pequenos RNAs é uma técnica de alto rendimento utilizada para investigar RNAs não codificantes, como microARNs (miRNA), siRNA e piRNA, entre outros. Este método permite a geração direta de sequenciação de miRNA bibliotecas de RNA total, lançando assim luz sobre o papel dos RNAs não codificantes. Através desta abordagem, podemos não apenas compreender como a regulação pós-transcricional afeta fenótipos, mas também identificar novos marcadores biológicos e capturar uma gama abrangente de espécies de pequenos RNAs e miRNAs.

Nature de alto rendimento: Uma corrida de sequenciação pode gerar mais de 5 milhões de leituras de sequência.

Alta sensibilidade: O sequenciamento de alto rendimento de pequenos RNAs possui uma sensibilidade intrinsecamente elevada, que pode detectar moléculas de RNA não codificante escassas. Esta característica permite aos investigadores identificar e quantificar RNAs não codificantes de baixa abundância, como os microARNs.

Abrangência: Esta metodologia permite a deteção e identificação de todos os tipos de moléculas de RNA pequeno presentes numa amostra, incluindo microRNAs, siRNAs e piRNAs, entre outros. Este nível de abrangência permite aos investigadores visualizar de forma completa o panorama expressivo dos RNAs não codificantes.

Alta Resolução: Sequenciação de pequenos RNAs permite a deteção de pequenas variações em RNA pequeno a nível de uma única base; Precisão: Quantificação altamente precisa que varia de algumas a várias milhões de cópias. Incluindo o seu comprimento e características estruturais, esta alta resolução permite que os investigadores aprofundem a função e os mecanismos regulatórios do RNA não codificante.

Sem Dependência de Informação Conhecida: Pode identificar pequenos RNAs conhecidos, bem como descobrir novos.

Excelentes Reprodutibilidade: O sequenciamento aprofundado garante a aleatoriedade das amostras, proporcionando uma excelente reprodutibilidade sem a necessidade de experiências repetidas.

Diversidade de Dados: A rica diversidade de dados gerados por sequenciação de pequenos RNAs fornece uma riqueza de informações benéficas para a investigação biológica. A análise de dados de sequenciação permite compreender os padrões de expressão de RNA não codificante, as suas redes regulatórias e as alterações relacionadas com doenças associadas.

Custo-eficiência: Com o avanço da tecnologia de sequenciação, os custos associados a sequenciação de RNA pequeno continuar a diminuir, tornando-o financeiramente acessível a um número crescente de laboratórios e projetos de investigação. Esta redução de custos não só diminui a barreira à investigação, mas também promove a ampla aplicação de estudos sobre RNA não codificante.

Os Desafios da Sequenciação de Pequenos RNAs

os dados de sequenciação de pequenos RNAs. Os investigadores descobriram gradualmente que os dados de sequenciação que contêm expressão diferencial de pequenos RNAs são, por vezes, inconsistentes com os resultados de microarrays, qPCR e blotting de Northern. Isto tem sido atribuído principalmente ao viés dependente da RNA-ligase para sequências de adaptadores particulares introduzidas durante a construção da biblioteca de pequenos RNAs. Estudos sugeriram que a aleatorização das sequências de adaptadores próximas à junção de ligação pode reduzir o viés de ligação e otimizar os resultados da sequenciação. O kit NEXTflex Small RNA-seq da Bioo Scientific é atualmente o único kit disponível comercialmente que reduz o viés associado à ligação. Este kit utiliza adaptadores com extremidades aleatórias de 4nt, o que proporciona uma cobertura mais uniforme de espécies individuais de pequenos RNAs. Um trabalho de Baran-Gale et al., (2015) sugeriu que o protocolo NEXTflex é o kit menos enviesado para. sequenciação de pequenos RNAs.

Tabela 1. Os kits comercialmente disponíveis para a construção de bibliotecas de pequenos RNAs.

As principais fontes de viés em sequenciação de pequenos RNAs inclua o viés de ligação e o viés de PCR. O viés de ligação resulta das diferenças na estrutura secundária do miRNA e dos adaptadores durante a reação de ligação, o que leva a que certos miRNAs tenham uma eficiência de ligação mais elevada do que outros. Isso, por sua vez, impacta a precisão dos dados. Várias estratégias para mitigar este problema incluem melhorar o design dos adaptadores para reduzir o viés, utilizar correções computacionais para ajustar os valores de expressão, empregar enzimas específicas para remover certas modificações e aumentar a aleatoriedade dos adaptadores.

Outra fonte de viés é o viés da PCR, causado pelas diferentes eficiências de amplificação de moléculas de vários comprimentos e estruturas secundárias durante o processo de PCR. Para aliviar este viés, códigos de barras moleculares poderiam ser utilizados para rotular produtos de PCR, distinguindo assim moléculas idênticas que foram amplificadas através da PCR. O passo final na sequenciação de pequenos RNAs O fluxo de trabalho é a sequenciação. Este passo pode estar associado a certos tipos de viés (como efeitos de pista e efeitos de pooling), mas esses vieses são geralmente considerados como vieses secundários que influenciam de forma subtil o nível geral de viés.

Atualmente, existem principalmente três métodos para abordar diferentes problemas de viés: (1) ligadura original de dois adaptadores; (2) ligadura melhorada de dois adaptadores; (3) métodos sem ligadura (baseados em adenilação). Além disso, um conjunto de tecnologias alternativas que dependem da hibridação de miRNA e sondas-alvo evita completamente as etapas de ligadura ou poliadenilação e, em certos casos, também elimina a fase de PCR e as leituras de NGS. Estas técnicas geralmente oferecem um fluxo de trabalho simplificado, adequado para análise rotineira e automatizada. No entanto, o seu espectro de miRNA analisável, determinado por um conjunto de sondas pré-projetadas, é limitado, restringindo assim o seu potencial para descoberta.

(1) Os métodos originais de ligadura de adaptadores em dois passos

O método tradicional de ligadura de adaptadores duplos envolve inicialmente a conexão de um adaptador 3' pré-adenilado, seguido pelo adaptador 5' (Fig.2). Esta abordagem é favorecida pela sua aplicabilidade a uma ampla gama de tipos de pequenos RNAs, pela sua capacidade de detectar RNAs com modificações específicas e pelo seu uso histórico prolongado. No entanto, existem limitações inerentes. O viés na ligadura de adaptadores pode levar à superestimação ou subestimação de certos miRNAs, ou potencialmente à sua detecção não ser realizada. A formação de dímeros de adaptadores pode comprometer a contagem de leituras, afetando ainda mais a precisão dos dados. Além disso, este método não consegue capturar tipos específicos de pequenos RNAs, como os snRNAs com modificações na extremidade 3'.

Figura 2. Protocolo original de ligadura de dois adaptadores para análise de RNA pequeno-seq. (Benesova et al., 2021)

(2) O método melhorado baseado na ligadura de dois adaptadores

Métodos melhorados de ligadura de adaptadores duplos visam mitigar ou contrariar os vieses de ligadura e PCR. Neste momento, estão disponíveis três técnicas: (i) acoplamento de ambos os adaptadores com nucleotídeos aleatórios (Figura 3A); (ii) ligadura de um único adaptador seguida de circularização (Figura 3B); e (iii) a integração de códigos de barras moleculares com um adaptador duplo. Adaptadores aleatórios reduzem o viés de ligadura através da inclusão de secções aleatórias, o que pode exigir uma gestão cuidadosa para evitar os impactos do viés de PCR. A abordagem de ligadura de adaptador único e subsequente circularização aproveita a circularização intramolecular para diminuir o viés de ligadura, embora ainda possam existir potenciais vieses na extremidade 3'. Em contraste, o método que envolve códigos de barras moleculares mitiga o viés de PCR ao incorporar códigos de barras moleculares.

Figura 3. Métodos melhorados de ligadura com dois adaptadores para análise de RNA pequeno-seq. A redução do viés de ligadura ou PCR é alcançada por: (A) adaptadores aleatórios; (B) ligadura de um único adaptador e circularização; e (C) códigos de barras moleculares. (Benesova et al., 2021)

Método sem ligadura

As abordagens sem ligadura incluem principalmente esquemas baseados em poliadenilação e troca de template (Fig. 4), bem como tecnologias baseadas em sondas, todas as quais permitem a análise direcionada de miARNs conhecidos. Estas técnicas oferecem um fluxo de trabalho simplificado e análise computacional, ao mesmo tempo que evitam os preconceitos associados aos passos de ligação e PCR. A abordagem que depende da poliadenilação e da troca de template utiliza a atividade de troca de template da transcriptase reversa (RTase) para adicionar adaptadores na extremidade 5', em oposição aos métodos tradicionais de ligação. A independência deste método em relação à ligação permite uma quantificação mais precisa dos miARNs, contornando os preconceitos introduzidos pelos passos de ligação. No entanto, apresenta certas desvantagens, incluindo algumas leituras que não se alinham com sequências de miARN, levando a taxas de mapeamento de miARN mais baixas e potenciais aumentos nos custos de sequenciação.

As tecnologias baseadas em sondas utilizam sondas específicas para a análise direcionada de miARNs conhecidos. Por exemplo, o Nanostring nCounter utiliza códigos de barras moleculares diretos e sondas codificadas por cores para a deteção digital de miARNs, tornando-o adequado para a quantificação de mais de 800 miARNs diferentes. O ensaio FirePlex miARN combina tecnologia de nanopartículas em hidrogel com regiões específicas de miARN e adaptadores universais, permitindo a quantificação de 65 espécies de miARN numa única reação e eliminando a variação introduzida pelo processo de separação. Entretanto, o EdgeSeq utiliza sondas que se ligam especificamente para a análise e sequenciação de miARN. O seu processo de preparação de bibliotecas é automatizado, e a análise computacional é padronizada, resultando em resultados comparáveis e fiáveis.

Figura 4. Mecanismo de poliadenilação e mudança de modelo aplicado na análise de RNA pequeno-seq. (Benesova et al., 2021)

O Fluxo de Trabalho de Sequenciação de Pequenos RNAs

O fluxo de trabalho de sequenciação de pequenos RNAs geralmente inclui a isolação total de RNA, construção de bibliotecas de pequenos RNAs, sequenciação profunda e análise bioinformática.

Figura 5. Caminho da tecnologia de sequenciação de pequenos RNAs.

Enriquecimento de Pequeno RNA

Dadas as características curtas dos pequenos RNAs, que normalmente variam entre 20 a 30 nucleotídeos (nt), é necessário enriquecer o RNA total extraído. Este processo pode ser realizado através da utilização de um kit específico de enriquecimento de pequenos RNAs, como o miRNeasy Mini Kit, ou através de eletroforese em gel seletiva por tamanho. As amostras utilizadas para o enriquecimento podem variar desde materiais celulares, tecidos, até vários fluidos corporais.

Construção de biblioteca de RNA pequeno

Os grupos fosfato 5' e hidroxilo 3' no pequeno RNA permitem que as ligases visem e capturem seletivamente estas espécies de RNA pequeno. Para sequenciação de RNA pequenoa construção de bibliotecas de RNA pequeno, começando tipicamente com a ligação do adaptador de DNA pré-adenilado ao extremo 3' dos sRNAs, utilizando uma versão truncada da T4 RNA ligase 2, seguida pela ligação de um adaptador de RNA ao extremo 5' usando a T4 RNA ligase 1. Após esta ligação, os produtos podem ser facilmente transcritos reversamente em cDNA e amplificados por PCR antes do sequenciamento em alta capacidade. Existem muitos kits comercialmente disponíveis que geram bibliotecas de RNA pequeno diretamente a partir de amostras de RNA total (Tabela 1). Os produtos são adequados para sequenciamento Illumina. Os princípios gerais da construção de bibliotecas de RNA pequeno estão delineados na Figura 6, mas diferentes kits podem ter alguns protocolos diferentes. O processo de purificação em gel é dedicado ao controle de qualidade e seleção de tamanho. De acordo com os seus interesses de pesquisa, o tamanho apropriado das sequências é recuperado por seleção de tamanho baseada em esferas ou purificação por PAGE para sequenciamento profundo. Uma biblioteca de cDNA com inserções de 18-40 bp é uma escolha típica que abrange miRNA, siRNA e piRNA. Por favor, note que o sequenciamento de miRNA e mRNA requer dois protocolos de biblioteca separados, mesmo com a mesma amostra de RNA total. Após o controle de qualidade das bibliotecas de RNA pequeno, o sequenciamento em alta capacidade é então realizado. As plataformas Illumina são os instrumentos mais populares para sequenciação de pequenos RNAs, como MiSeq e HiSeq.

Figura 6. Os princípios da construção de bibliotecas de pequenos RNAs.

Análise bioinformática

Sequenciação de RNA pequeno pode ser utilizado para agrupamento de pequenos RNAs, descoberta de novos pequenos RNAs, previsão de alvos de miRNAs, expressão diferencial de pequenos RNAs, análise evolutiva e análise funcional. Mas, antes disso, os dados de sequenciamento brutos precisam ser pré-processados e normalizados. O pré-processamento de dados envolve a remoção de adaptadores e códigos de barras, seleção de tamanho, remoção de leituras complexas e a geração de leituras únicas. A normalização é o processo de tornar os níveis de expressão comparáveis entre bibliotecas. Rfam e miRBase são duas bases de dados comuns para análise de pequenos RNAs. Rfam é uma base de dados de acesso aberto que fornece informações sobre tRNA, rRNA e snoRNA, etc. miRBase contém sequências e anotações de todos os miRNAs conhecidos entre espécies.

Figura 7. O fluxo de trabalho da análise bioinformática de dados de sequenciação de pequenos RNAs (Buschmann et al. 2016).

Controlo de Qualidade de Dados: A fiabilidade dos resultados da análise de informação depende da qualidade dos dados de sequenciação. Assim, os dados brutos de sequenciação de sRNA passam por processos rigorosos de controlo de qualidade, incluindo a remoção de adaptadores, eliminação de sequências que contêm bases N, filtragem de bases de baixa qualidade e seleção de comprimento. Isto garante a obtenção de dados de sequenciação de alta qualidade, ao mesmo tempo que facilita a enumeração das espécies de RNA pequeno e a caracterização da sua distribuição de comprimento.

Alinhamento de Genoma de Referência: A partir das leituras limpas obtidas após a seleção de comprimento de cada amostra, é realizada a alinhamento ao genoma de referência, seguido pela análise estatística dos resultados do alinhamento.

Análise de miRNA Conhecido: O alinhamento das leituras à base de dados de miRNA permite a identificação de microARNs conhecidos.

Análise de ncRNA: O alinhamento de leituras a sequências de ncRNA específicas de espécies ou à base de dados Rfam facilita a identificação de rRNA, tRNA, snRNA e snoRNA.

Predição de miRNA Novos: Utilizando o miREvo para a previsão de novos miRNA, acompanhada de análises da preferência de nucleotídeos e da estrutura secundária.

Expressão Génica e Análise Diferencial: Quantificação de miRNAs conhecidos e novos com base nos resultados de alinhamento, seguida de análise diferencial de miRNAs para elucidar a expressão diferencial entre amostras ou grupos.

Predição de Genes Alvo de miRNA: Aproveitando as ferramentas de software miRanda e RNAhybrid para a previsão de genes-alvo de miRNA diferenciais.

Enriquecimento Funcional: Utilizando bases de dados de anotação funcional como o GO e o KEGG, obtém-se um enriquecimento significativo de informação funcional relacionada com os genes-alvo de miRNA diferencialmente expressos entre amostras ou grupos.

Aplicação de Sequenciação de Pequenos RNAs

Sequenciação de RNA pequeno é uma técnica fundamental na biologia, amplamente utilizada em diversos domínios de pesquisa, particularmente na regulação genética, diagnóstico de doenças e investigação biomédica.

Análise da Expressão de miRNA:

Os microARNs (miARNs) são RNAs não codificantes essenciais implicados na regulação da expressão génica. Sequenciação de pequenos RNAs permite uma avaliação abrangente e de alto rendimento dos níveis de expressão de miRNA, elucidando assim as redes funcionais e regulatórias dos miRNAs dentro dos organismos.

Pesquisa Funcional de miRNA:

Utilizando sequenciação de RNA pequeno permite a identificação de genes-alvo de miRNA e a exploração adicional das interacções mútuas entre os miRNAs e os seus alvos. Esta abordagem aprofunda-se na desvendar das funções biológicas e dos mecanismos regulatórios dos miRNAs.

Descoberta de Biomarcadores:

Dadas as funções cruciais das miARNs no início e na progressão de inúmeras doenças, a sequenciação de pequenos RNAs serve como uma ferramenta poderosa para descobrir miARNs associados a doenças. Consequentemente, oferece potencial biomarcadores para diagnóstico de doenças e intervenções terapêuticas.

Investigação das Associações entre miRNA e Doenças:

Ao sobrepor perfis de expressão de miRNA em estados saudáveis e doentes, é possível discernir miRNAs associados a doenças. Esta revelação pode fornecer insights significativos para elucidar a patogénese da doença e gerar metodologias de tratamento inovadoras.

Pesquisa sobre Interacções miRNA-fármacos:

Sequenciação de RNA pequeno pode facilitar a exploração das interações entre miARNs e fármacos. Isso inclui a influência de compostos farmacêuticos na expressão de miARNs, bem como o papel regulador dos miARNs no metabolismo de fármacos e na eficácia terapêutica.

Investigações sobre a Evolução Biológica:

A análise comparativa dos perfis de expressão de miRNA entre diferentes espécies ou indivíduos através de sequenciação de RNA pequeno pode destacar a conservatividade e diversidade dos miRNA no processo evolutivo dos organismos.

Pesquisa sobre Resposta ao Stress Ambiental:

Dada a função crítica do miRNA na resposta de um organismo ao stress ambiental, empregando sequenciação de RNA pequeno fornece um método para estudar como referido stress influencia o perfil de expressão de miRNA, sondando assim os mecanismos subjacentes da adaptação biológica.

Figura 8. Aplicações de modificações de RNA pequeno. (Xiong et al., 2023)

Para mais detalhes pipeline de bioinformática para sequenciação de pequenos RNAs, por favor consulte esta página. Além de sequenciação de RNA pequeno, fornecemos ainda outros sequenciação transcriptómica serviços, incluindo RNA-seq, sequenciação de RNA bacteriano, sequenciação de lncRNA, sequenciação de circRNA e sequenciação de degradoma.

Referências:

1. Baran-Gale J, Kurtz C L, Erdos M R, et al. Abordagem do Viés na Preparação de Bibliotecas de RNA Pequeno para Sequenciação: Um Novo Protocolo Recupera MicroRNAs que Evitam a Captura pelos Métodos Actuais. Fronteiras em Genética, 2015, 6(e73240).
2. Buschmann D, Haberberger A, Kirchner B, et al. Em direção a assinaturas de biomarcadores fiáveis na era das biópsias líquidas - como padronizar o fluxo de trabalho de RNA-Seq pequeno. Pesquisa em ácidos nucleicos, 2016, 44(13): 5995-6018.
3. Fuchs R T, Sun Z, Zhuang F, et al. O viés na construção de bibliotecas de sequenciação de pequenas RNAs baseada em ligadura é determinado pela estrutura do adaptador e do RNA. Plos One, 2015, 10(5): e0126049.
4. Benesova S, Kubista M, Valihrach L. Sequenciação de pequenos RNAs: abordagens e considerações para a análise de miARNs. Diagnósticos, 2021, 11(6): 964.
5. Xiong Q, Zhang Y. Modificações de RNA pequeno: moléculas reguladoras e potenciais aplicações. Revista de Hematologia e Oncologia, 2023, 16(1): 64.