Resumo dos Métodos de Detecção de Alvos Não Intencionais do CRISPR-Cas9

A tecnologia de edição do genoma está na vanguarda da investigação atual em ciências da vida. No entanto, para a sua tradução bem-sucedida em aplicações clínicas, a precisão detecção de efeitos fora do alvo é indispensável. Avaliar e mitigar corretamente os efeitos fora do alvo é uma preocupação urgente. A questão dos efeitos fora do alvo na tecnologia de edição genética CRISPR-Cas9 tem sido um foco de atenção há muito tempo. Existem duas abordagens principais para examinando os efeitos fora do alvo do CRISPR-Cas9métodos de simulação computacional e métodos de sequenciação ^[1].

Métodos de Sequenciamento para Detecção de Alvos Indesejados do CRISPR-Cas9

Sequenciação do Genoma Completo (WGS)

O Sequenciamento de Genoma Completo (WGS) está associado a um viés de avaliação mínimo no contexto da avaliação de mutações fora do alvo induzidas pelo Cas9. Atualmente, profundidades de sequenciamento de 30-60x são tipicamente empregues. No entanto, o custo do WGS é elevado e, com profundidades de sequenciamento mais baixas, apenas um pequeno número de clones pode ser sequenciado, potencialmente perdendo a maioria dos eventos fora do alvo de baixa frequência. Para análise in vivo, o WGS continua a ser o método preferido, no entanto, técnicas que capturam diretamente Quebras de Cadeia Dupla (DSBs), como o BLESS, podem oferecer capacidades superiores em comparação com o WGS. Isto porque o WGS também pode capturar variações naturalmente ocorrentes entre modelos celulares/animais, o que pode complicar a análise e levar a resultados enganosos.

Na análise de WGS, a seleção de grupos de controlo apropriados é particularmente crucial. Para minimizar falsos positivos e negativos em WGS, a análise frequentemente requer a configuração de múltiplos grupos, o que pode ser tanto trabalhoso quanto dispendioso.

Chip-Seq

As nucleases Cas, uma classe de proteínas, podem ser submetidas a uma captura por anticorpos seguida de sequenciação, um método conhecido como ChIP-Seq. O ChIP-Seq é frequentemente utilizado no contexto da deteção de efeitos fora do alvo associados ao dCas9. Em contraste com o Cas9 convencional, que corta a sequência alvo, levando à sua dissociação da sequência de DNA e a uma ligação instável, o dCas9, caracterizado pela incapacidade de atividade nuclease, mantém a capacidade de se ligar à sequência alvo guiado pelo gRNA. Como resultado, o dCas9 é frequentemente aplicado para ativação CRISPR (CRISPRa) para aumentar a expressão génica em vez de para knockout génico.

DISCOVER-seq, também conhecido como MRE11 ChIP-Seq, é um método recentemente desenvolvido para sequenciação de alvos fora do alvo do CRISPR-Cas9. Esta abordagem aproveita o recrutamento do fator endógeno de reparo do DNA MRE11 para identificar quebras de dupla hélice induzidas por Cas em todo o genoma. Durante o processo de reparo do DNA, o MRE11 é precisamente recrutado para o local da ocorrência de DSB. Consequentemente, através da captura de locais ligados ao MRE11 e sequenciação de alto rendimento, este método permite a análise simultânea de ocorrências tanto no alvo como fora do alvo. Importante, o DISCOVER-seq é aplicável a amostras in vivo e in vitro.

discover-seq

Sequenciação de Enriquecimento de Local de Clivagem da Cas Nuclease e Local de Quebra de Cadeia Dupla (DSB)

O método de sequenciação que se baseia na enriquecimento de regiões ligadas ou clivadas por nucleases Cas é comumente referido como uma abordagem de deteção não enviesada. Seguindo esta lógica, foram desenvolvidos métodos de enriquecimento, incluindo:

(1) Captura de Anticorpos:

Como o Chip-Seq, onde anticorpos são usados para capturar as regiões-alvo.

(2) Enriquecimento de Locais de Clivagem da Nuclease Cas:

Digenome-Seq, abreviação de sequenciação de genoma completo digerido por Cas9 in vitro. Após a clivagem pelo Cas9, um grupo fosfato 5' é deixado para trás, o que permite a ligação de adaptadores para amplificação por PCR e subsequente sequenciação por NGS. Na Digenome-Seq, o DNA genómico purificado (gDNA) é tratado com Cas9 in vitro, seguido pela ligação de adaptadores e sequenciação abrangente do genoma completo. Este método é adequado para amostras in vitro.

(3) Enriquecimento de Regiões de Quebra de Cadeia Dupla de DNA (DSB) - Captura de DSB:

No BLESS-Seq, é utilizada a enriquecimento por afinidade à biotina para capturar fragmentos de DSB guiados por CRISPR-Cas9, que podem ser sequenciados após a ligação de adaptadores. O enriquecimento por afinidade à biotina captura especificamente DSBs que estão a ocorrer ativamente, deixando DSBs já reparados de fora, o que lhe confere a designação de "instantâneo de off-target". Este método é frequentemente aplicado a amostras de células e tecidos.

No IDLV-Seq, o vetor lentiviral deficiente em integração (IDLV) pode ser utilizado como um âncora de PCR para amplificar os locais de DSB gerados através da junção de extremidades não homólogas (NHEJ). Isso permite a deteção de locais fora do alvo. No entanto, a eficiência deste método depende da capacidade do IDLV de se integrar nos DSBs através da NHEJ. Além disso, devido às características de integração aleatória dos lentivírus, existe a possibilidade de falsos positivos.

HTGST é adequado para detectar translocações cromossómicas induzidas pelo CRISPR-Cas9, mas é importante notar que os eventos fora do alvo induzidos pelo CRISPR-Cas9 resultam principalmente em indels, que são relativamente menos frequentes. Além disso, este método ainda está sujeito a limitações impostas pela acessibilidade da cromatina.

método imparcial

Comparado com métodos que enriquecem os locais de clivagem das nucleases, os métodos de captura de DSB são mais relevantes fisiologicamente. No entanto, podem apresentar uma eficiência inferior, uma vez que a maioria dos DSBs tem uma duração muito curta. A marcação in vivo de IDLV e a ligação de ligadores in situ podem ser potencialmente influenciadas pela composição local da cromatina e da sequência próxima ao local de clivagem. Consequentemente, os métodos de captura podem estar sujeitos a viéses.

Resumo dos Métodos de Sequenciação

Existem numerosos métodos de sequenciação disponíveis, tornando inviável fornecer descrições exaustivas de cada um. A tabela apresentada abaixo oferece a compilação mais abrangente atualmente acessível. Dada a informação fornecida anteriormente, não é viável determinar de forma definitiva o método superior. A seleção da técnica de sequenciação mais apropriada deve ser orientada pelas necessidades específicas do experimento e pelos recursos financeiros à disposição da equipa de investigação.

Métodos de Simulação Computacional para Detecção de Alvos Indesejados do CRISPR-Cas9

Estas técnicas servem para prever potenciais sequências fora do alvo, principalmente devido à semelhança entre sequências-alvo e outras sequências ou à especificidade limitada das RNAs guias (gRNAs). As potenciais sequências fora do alvo podem ser deduzidas através da integração de dados experimentais ou da utilização de algoritmos computacionais. Para validar os efeitos fora do alvo, recorre-se frequentemente ao sequenciamento de produtos de PCR. Estas abordagens são frequentemente denominadas de "tendenciosas", e o funcionamento das ferramentas de previsão de off-target pode ser classificado em dois mecanismos principais: (1) modelos baseados em alinhamento de sequências e (2) previsões que dependem de pontuações baseadas em algoritmos. ^[1].

À medida que a utilização da tecnologia CRISPR se torna mais generalizada, as expectativas em relação à sua aplicação também aumentam. Muitas vezes, ao empregar a tecnologia CRISPR, os desenhos experimentais podem não incluir grupos de controlo adicionais, o que pode representar desafios em experimentos subsequentes. Portanto, é aconselhável realizar prontamente uma análise de off-target após usar o CRISPR para edição genética ou reter amostras em estágios iniciais. Tanto as células como os animais são suscetíveis a mutações espontâneas.

Referências:

1. Naeem, Muhammad et al. Últimas Estratégias Desenvolvidas para Minimizar os Efeitos Fora do Alvo na Edição Genómica Mediadas por CRISPR-Cas. Células vol. 2020
2. Ipek Tasan e Huimin Zhao. Especificidade de Alvo do Sistema CRISPR/Cas9.ACS Biologia Sintética 2017 
3. Wienert, B., Wyman, S.K., Yeh, C.D. et al. Detecção de alvos fora do CRISPR com DISCOVER-seq. Nat Protoc 15, 1775–1799 (2020)