Sequenciação de Nova Geração: Validando a Sua Edição CRISPR/Cas9

O que é a tecnologia CRISPR/Cas9?

A tecnologia CRISPR/Cas9 é um dos métodos mais populares utilizados para edição do genoma, introduzindo tanto a endonuclease Cas9 como um RNA guia nas células de interesse. O RNA guia é projetado para direcionar a endonuclease Cas9 para um local específico no genoma, onde produz uma quebra de dupla fita (DSB). Existem geralmente duas maneiras de reparar a quebra de dupla fita: junção de extremidades não homólogas (NHEJ) ou reparo dirigido homólogo (HDR). A NHEJ é a principal forma de reparo em células mamíferas. Como é propensa a erros, o reparo através da via NHEJ permite inserções, deleções e mutações de perda de função que provavelmente resultam em deslocamentos de quadro e afetam a expressão de proteínas. Além das mutações de knockout, um DNA molde pode ser introduzido para direcionar o HDR e criar mutações no gene de interesse. O HDR copia fielmente a sequência do molde para o local alvo cortado.

Figura 1. A edição do genoma pela tecnologia CRISPR/Cas9 é realizada através da reparação.

Como Usar NGS para Validação de Edição Genómica

Embora o sistema CRISPR seja eficiente para a edição do genoma, algumas células numa população não serão editadas, algumas terão um alelo editado e algumas terão ambos os alelos editados. É importante validar as edições do genoma após os experimentos com CRISPR/Cas9. Sequenciação de próxima geração (NGS), como uma abordagem poderosa e de alto rendimento, pode ser utilizada para a triagem de mutações induzidas por CRISPR. NGS pode simultaneamente analisar alterações fora do alvo em um grande número de amostras. Ao usar este método, é necessário manter um conjunto de células de controlo. Software como o CRISPResso pode ser utilizado para a análise de dados. NGS também é adequado para avaliar edições genómicas criadas por ZFN (nuclease de dedo de zinco) ou TALEN (nuclease de efeito ativador de transcrição semelhante).

Sentmanat et al. (2018) descreveu o NGS abordagem para validação de edições genómicas no seu trabalho publicado. Resumidamente, Sequenciação CRISPR envolve um protocolo de PCR em duas etapas e sequenciação profunda. Primeiro, o local genómico alvo de interesse é amplificado com um primer que contém adaptadores de sequenciação Illumina parciais. Em seguida, realiza-se uma segunda PCR com primers que contêm índices e os adaptadores de sequenciação Illumina necessários. Como resultado, as regiões alvo serão amplificadas. Os produtos de PCR qualificados são então submetidos a sequenciação profunda na plataforma Illumina MiSeq.

NGS as técnicas de validação abrangem várias abordagens-chave:

Sequenciação do Genoma Completo (SGC) destaca-se como um método abrangente para discernir as alterações genómicas induzidas pelo CRISPR/Cas9. Ao sequenciar todo o genoma, WGS oferece uma cobertura sem igual para identificar inserções, deleções e outras alterações. Esta técnica é fundamental na avaliação da eficácia da edição CRISPR/Cas9, ao mesmo tempo que revela mutações raras dentro do genoma.

A Sequenciação de Amplicões Direcionada, por outro lado, foca em regiões genómicas específicas, incluindo locais-alvo do CRISPR/Cas9 e áreas vizinhas. Com uma alta profundidade de cobertura, esta técnica destaca-se na deteção de mutações minuciosas, servindo como uma ferramenta valiosa para corroborar a precisão das alterações do CRISPR/Cas9. É particularmente benéfica para avaliar edições em genes individuais ou um conjunto limitado de alvos.

A Análise de Off-Target é fundamental na previsão e sequenciação de potenciais locais off-target gerados por modificações CRISPR/Cas9. Este método ajuda na avaliação da especificidade e segurança das edições CRISPR/Cas9, identificando alterações não intencionais. Desempenha um papel crucial na avaliação da precisão e dos perfis de segurança das metodologias de edição CRISPR/Cas9.

A PCR de longo alcance e o sequenciamento adotam uma abordagem complementar ao amplificar grandes regiões genómicas em torno dos locais-alvo do CRISPR/Cas9 antes do sequenciamento. Este método é eficaz na captura de variações estruturais e rearranjos cromossómicos resultantes das manipulações do CRISPR/Cas9. Revela-se uma ferramenta valiosa na deteção de alterações genómicas substanciais induzidas pelos procedimentos de edição do CRISPR/Cas9.

Figura 2. Atividade do CRISPR-Cas9 reportada com o ensaio T7E1 e sequenciação de nova geração. (Sentmanat et al., 2018)

Como são Detetadas as Mutação Off-Target

Outra limitação da tecnologia CRISPR é a ocorrência de cortes fora do alvo. O sistema CRISPR corta não apenas no seu local alvo, mas também em locais não intencionais com sequências semelhantes. Esses cortes fora do alvo podem produzir mutações indesejáveis e até prejudiciais. Nos últimos anos, os cientistas estabeleceram várias NGSabordagens baseadas para detectar mutações fora do alvo.

Tabela 1. Abordagens baseadas em NGS para detectar mutações fora do alvo.

Referências:

1. Yan W X, Mirzazadeh R, Garnerone S, et al. O BLISS é um método versátil e quantitativo para o perfilamento em todo o genoma de quebras de dupla hélice de DNA. Comunicações da Natureza, 2017, 8: 15058.
2. Sentmanat M F, Peters S T, Florian C P, et al. Um inquérito sobre estratégias de validação para edição CRISPR-Cas9. Relatórios científicos, 2018, 8(1): 888.
3. Frock R L, Hu J, Meyers R M, et al. Detecção genómica de quebras de dupla hélice de DNA induzidas por nucleases engenheiradas. Biotecnologia da Natureza, 2015, 33(2): 179.
4. Cameron P, Fuller C K, Donohoue P D, et al. Mapeamento da paisagem genómica da clivagem CRISPR–Cas9. Métodos da Natureza, 2017, 14(6): 600.
5. Kim D, Bae S, Park J, et al. Digenome-seq: perfilamento genómico abrangente dos efeitos off-target do CRISPR-Cas9 em células humanas. Métodos Nat, 12:237-43, 2015.
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