Sequenciação CRISPR: Introdução, Fluxo de Trabalho e Aplicações

O sistema CRISPR-Cas9

O sistema de direcionamento de genes CRISPR-Cas9, que consiste em dois componentes: um RNA guia personalizado (sgRNA, que contém a sequência crRNA específica do alvo e tracrRNA) e uma endonuclease associada ao CRISPR não específica (Cas9), é uma nova ferramenta de engenharia genômica que permite aos cientistas modificar partes do genoma removendo, adicionando ou alterando uma seção da sequência de DNA em um organismo. Atualmente, é o método de manipulação genética mais simplificado, flexível, preciso e eficiente, com inúmeras aplicações na medicina e na melhoria de sementes de culturas. O CRISPR-Cas9 também revolucionou a geração de mutações direcionadas ao permitir a edição de genomas em alta capacidade.

Introdução ao Sequenciamento CRISPR

No processo de experimentação com CRISPR, validar as edições é particularmente crucial. Como mutações fora do alvo, em vez de edições no gene alvo, podem ocorrer, o sequenciamento de nova geração (NGS) é uma técnica simples e de alta capacidade para verificar mutações preferenciais. Para a academia, clínicas e indústria, o sequenciamento de amplicons CRISPR tornou-se um método de validação padronizado. A ideia de triagem CRISPR em alta capacidade é focada no sequenciamento de amplicons direcionados, que é feito usando experimentos de PCR com primers que cercam a área focada. A técnica mais delicada para verificar mutações é o sequenciamento de amplicons direcionados, que tem frequências de detecção tão baixas quanto 0,01%.

Figura 1. Estratégias de enriquecimento baseadas em CRISPR para sequenciamento direcionado. (Schultzhaus, 2020)

O sequenciamento CRISPR pode fornecer dados diretos e abrangentes sobre a natureza e variedade das mutações, como confirmação de alelos knockout/knockin, avaliação da eficiência de corte do sgRNA, identificação de homozigotos e heterozigotos, cálculo de frequências de mutação, e assim por diante.

Fluxo de Trabalho do Sequenciamento CRISPR

A isolação de DNA, experimentos de PCR, sequenciamento profundo e análise de dados fazem parte do fluxo de trabalho de sequenciamento de mutações CRISPR. Os pesquisadores podem usar o sequenciamento de mutações CRISPR para verificar a biblioteca de guias, avaliar os alvos e a eficiência de mutação do CRISPR/Cas9, e encontrar os locais alvo mais promissores.

Passo 1: Designar - Selecionar uma enzima Cas e criar um RNA guia.

Passo 2: Entregar - Recomenda-se combinar a enzima Cas e o RNA guia para formar uma ribonucleoproteína para entregar a enzima Cas e o RNA guia às células (RNP). A eletroporação ou lipofecção podem ser usadas para entregar a RNP às células. Para melhorar a eficiência de transfecção, podem ser utilizados melhoradores de eletroporação separados para Cas9 e Cas12a.

Passo 3: Reparar - RNPs contendo Cas9 ou Cas12a cortam o DNA genômico, causando uma quebra de dupla fita (DSB). A junção de extremidades não homólogas (NHEJ) e a reparação dirigida por homologia (HDR) são processos naturais nas células. O caminho NHEJ pode ser usado para criar knockouts a fim de estudar a função do gene. A HDR requer não apenas RNP para criar o DSB, mas também um modelo para direcionar a reparação, e pode ser empregada para introduzir mutações específicas.

Passo 4: Analisar - Dependendo das necessidades da sua pesquisa, você pode usar uma variedade de métodos para detectar mutações. Metodologias baseadas em gel podem ser usadas para determinar a presença de uma transição em uma sequência genômica de forma não específica. O sequenciamento de nova geração (NGS) é fortemente aconselhável para estabelecer o sucesso da edição no alvo e investigar efeitos fora do alvo.

Aplicações

A tecnologia CRISPR-Cas9 transformou a capacidade de modificar o DNA e modular os níveis de expressão de genes de interesse, fornecendo ferramentas eficazes para acelerar a engenharia precisa de uma variedade de organismos. Além disso, o sistema CRISPR-Cas pode ser usado para criar antimicrobianos de "precisão" que visam patógenos bacterianos com base em sua sequência de DNA. Ao direcionar seletivamente genes associados à resistência a antibióticos, formação de biofilme e virulência, esse potencial permitirá que micróbios resistentes a medicamentos sejam eliminados.

Referências:

1. Schultzhaus Z, Wang Z, Stenger D. Estratégias de enriquecimento baseadas em CRISPR para sequenciamento direcionado. Biotechnology Advances. 28 Nov 2020:107672.
2. de la Fuente-Núñez C, Lu TK. Tecnologia CRISPR-Cas9: aplicações em engenharia genômica, desenvolvimento de antimicrobianos específicos de sequência e perspectivas futuras. Integrative Biology. 1 Fev 2017;9(2).
3. Selle K, Barrangou R. Tecnologias baseadas em CRISPR e o futuro da ciência alimentar. Journal of food science. Nov 2015;80(11).
4. Makarova KS, Wolf YI, Alkhnbashi OS, et al. Uma classificação evolutiva atualizada dos sistemas CRISPR–Cas. Nature Reviews Microbiology. Nov 2015;13(11).