Sequenciação V(D)J de Células Únicas de Alto Rendimento: Introdução, Princípio e Fluxo de Trabalho

Diversidade e mecanismos moleculares da imunidade específica

O sistema imunitário é dividido em imunidade não específica e específica, dependendo de estar "direcionado" para o "não próprio" ou não. A base molecular da imunidade específica "direcionada" é assumida pelas moléculas do receptor imunitário de células T/células B (TCR/BCR) expressas na superfície dos linfócitos T/B, e um "não próprio" corresponde a um TCR ou BCR.

Existem inúmeros patógenos na natureza, mas as células humanas têm apenas cerca de 25.000 genes, então como é que satisfazem a necessidade de diversidade de TCR/BCR? A resposta está relacionada ao alto grau de rearranjo dos genes que codificam TCR/BCR.

Recombinação VDJ no sistema imunitário. (Kaeser et al. 2020)

As regiões altamente variáveis na molécula TCR/BCR são codificadas por combinações de genes V, D e J, e uma ampla variedade de TCR/BCRs é gerada através de rearranjos genéticos altamente variáveis, como combinações modulares de permutações e mutações. No BCR, por exemplo, existem cerca de 40 módulos V diferentes, 25 módulos D diferentes e 6 módulos J diferentes no gene humano. As células B selecionam um dos módulos de genes V, D, J e C, respetivamente, as células B selecionam um deles e juntam-nos para montar um gene codificador de BCR maduro, resultando em 2400 combinações.

Da mesma forma, as células T sofrem rearranjo genético para gerar diversos TCRs. No entanto, o processo de rearranjo do gene TCR envolve a seleção e rearranjo de segmentos de genes variáveis (V), de junção (J) e constantes (C). A combinação de diferentes segmentos de genes V e J contribui para a diversidade dos TCRs.

Consulte o nosso artigo Visão Geral das Estratégias para Perfilagem de TCR Baseada em Sequenciamento de Nova Geração para informações detalhadas.

Relativamente às diferenças na resposta ao novo coronavírus (SARS-CoV-2), a variabilidade nos TCRs e BCRs entre indivíduos pode contribuir para variações nas respostas imunitárias. Algumas pessoas podem ter TCRs e BCRs que são mais adequados para reconhecer e combater o vírus, resultando numa infeção mais leve ou assintomática. Por outro lado, indivíduos com TCRs e BCRs que são menos eficazes em reconhecer o vírus podem experienciar uma doença mais grave.

Para obter uma compreensão mais profunda dos tipos e diferenças quantitativas das moléculas TCR e BCR nas respostas imunitárias, os investigadores podem empregar sequenciamento V(D)J de célula única de alto rendimento. Esta tecnologia permite a análise de células T ou B individuais, proporcionando informações sobre a diversidade e composição do repertório imunitário a nível de célula única. Estudos desse tipo podem contribuir para a nossa compreensão das respostas imunitárias a infeções, doenças autoimunes e outros distúrbios relacionados com o sistema imunitário.

Introdução à tecnologia de sequenciamento V(D)J de célula única

A tecnologia de sequenciamento V(D)J de célula única de alto rendimento é capaz de capturar mRNA de milhares de células únicas ao mesmo tempo a nível de célula única, obtendo informações de expressão de genes V(D)J para cada linfócito T e linfócito B, enquanto obtém o perfil completo de expressão gênica de cada célula.

Para satisfazer as necessidades de "alto rendimento" e "célula única", o sequenciamento V(D)J de célula única de alto rendimento é principalmente alcançado através do uso de chips microfluídicos de gotículas e microesferas com etiquetas moleculares.

Uma suspensão de células única obtida pela dissociação da amostra, microesferas rotuladas molecularmente, kit de transcrição reversa e óleo de geração de gotículas são adicionados aos poços do chip microfluídico de gotículas.

Ao controlar a taxa de fluxo das microesferas, células e reagentes no canal de fluxo microfluídico, as microesferas, células e reagentes podem ser emparelhados na proporção desejada e finalmente entrar na fase oleosa através da fase aquosa, o que pode enclausurar as células e microesferas na emulsão óleo-em-água, formando assim um estado de célula única.

Após as células entrarem na emulsão óleo-em-água, a membrana celular se rompe para liberar moléculas de mRNA. As moléculas de mRNA são capturadas por estruturas como poliT ou C-C-C na extremidade dos milhões de oligonucleotídeos de cadeia simples carregados nas microesferas. Cada oligo carrega tanto um Código de Barras Celular quanto uma Etiqueta de Transcrito (códigos de barras moleculares), de modo que mesmo que dezenas de milhares de células sejam misturadas para experimentos subsequentes de transcrição reversa e construção de bibliotecas, os dados da biblioteca ainda podem ser divididos para cada célula e restaurados ao verdadeiro nível de expressão gênica utilizando o Código de Barras Celular e os códigos de barras moleculares durante a fase de análise de dados.

Por favor, leia o nosso artigo Sequenciamento do Repertório Imunitário: Introdução, Fluxo de Trabalho e Aplicações para mais informações.

Fluxo de Trabalho do Sequenciamento V(D)J de Célula Única

O sequenciamento V(D)J de célula única de alto rendimento também requer a dissociação de amostras de tecido em suspensões de células únicas, seguida pela formação de estruturas água-em-óleo com chips microfluídicos para completar a separação de células únicas, seguida pela captura de ácidos nucleicos e construção de bibliotecas de transcriptoma e TCR/BCR.

Sequenciamento massivamente paralelo de receptores de células B de célula única. (Goldstein et al., 2019)

Os principais passos desde a isolamento celular até a construção da biblioteca são os seguintes:

Passo 1: Na estrutura água-em-óleo, a membrana celular é dissolvida para liberar moléculas de mRNA intracelular.

Passo 2: As moléculas de mRNA são sintetizadas em cDNA de cadeia simples pela transcriptase reversa. As moléculas de cDNA são capturadas por oligonucleotídeos com Código de Barras Celular e sintetizadas em moléculas de DNA de cadeia dupla. Neste processo, cada molécula de DNA é marcada com uma etiqueta celular.

Passo 3: Pegue algumas dessas moléculas de cDNA de cadeia dupla para completar a construção e sequenciamento de uma biblioteca de transcriptoma de perfil de expressão gênica completo (as moléculas de cDNA de todas as células são misturadas juntas neste processo para construir uma biblioteca híbrida multicelular).

Passo 4: Pegue algumas das moléculas de cDNA de cadeia dupla e complete a construção e sequenciamento da biblioteca V(D)J combinando os primers da região conservada do gene V(D)J (todas as moléculas de cDNA das células são misturadas juntas neste processo para construir uma biblioteca híbrida multicelular).

Na fase subsequente de análise de dados, a biblioteca de transcriptoma e a biblioteca V(D)J podem ser reduzidas ao nível de célula única com base nas etiquetas celulares, que podem ser usadas para entender o perfil de expressão gênica e as informações de expressão do gene V(D)J de cada célula. O perfil completo de expressão gênica de cada célula, combinado com genes marcadores expressos especificamente em diferentes tipos celulares, permite a anotação celular de cada célula para entender quais tipos de células estão presentes em cada amostra, o número de cada célula e a expressão gênica de cada célula. Em combinação com a biblioteca V(D)J, é possível saber qual gene V(D)J está expresso em cada linfócito T ou B e qual molécula TCR/BCR lhe corresponde.

Referências:

1. Kaeser, Gwendolyn, e Jerold Chun. "Recombinação gênica somática de células cerebrais e suas fundações filogenéticas." Journal of Biological Chemistry 295.36 (2020): 12786-12795.
2. Goldstein, Leonard D., et al. "Sequenciamento massivamente paralelo de receptores de células B de célula única permite a descoberta rápida de anticorpos reativos a antígenos diversos." Communications biology 2.1 (2019): 304.