Visão Geral da Estratégia para Profilagem de TCR Baseada em Sequenciamento de Próxima Geração

Visão Geral dos Receptores de Células T (TCRs)

O sistema imunitário adaptativo humano conduz a resposta imunitária através de imunoglobulinas geradas por células B e TCRs semelhantes a imunoglobulinas nas células T linfocitárias. Os TCRs são responsáveis pelo reconhecimento das moléculas Ag-MHC (complexo principal de histocompatibilidade). Normalmente, os TCRs consistem em cadeias α e β altamente variáveis expressas pela maioria das células T, ou cadeias γ e δ expressas por um subconjunto de células T (1–5%). As cadeias TCR consistem numa região variável para reconhecimento de antígenos e uma região constante. A região variável das cadeias α e δ é codificada por genes variáveis (V) e de junção (J), enquanto as cadeias β e γ são codificadas por genes de diversidade (D). Cada cadeia TCR contém três laços hipervariáveis, ou seja, regiões determinantes de complementaridade (CDR1–3). A especificidade antigénica dos TCRs é principalmente determinada pelo CDR3 hipervariável da cadeia beta, que é formada pela recombinação de segmentos de genes V, D e J com a adição de nucleotídeos aleatórios nas junções dos segmentos de genes. A soma de todos os TCRs de um corpo humano é denominada repertório TCR ou perfil TCR, que pode mudar significativamente com o início e a progressão de doenças. Assim, é mais importante determinar o estado do repertório imunitário sob diferentes condições de doença.

Figura 1. Interação entre uma célula apresentadora de antígenos (APC) e uma célula T (a), e recombinação V(D)J (b) (Rosati et al., 2017).

Sequenciamento de TCR

O sequenciamento de nova geração (NGS) revolucionou a profilagem do repertório de TCR através da capacidade de analisar massivamente os repertórios de TCR e anticorpos a partir de amostras de sangue. Neste artigo, focamo-nos principalmente no sequenciamento de TCR baseado em populações celulares.

• Cadeias ou regiões CDR

As células T γδ são menos interessantes, uma vez que são frequentemente encontradas em locais mucosos. A cadeia β é o principal alvo de interesse devido à sua singularidade em células únicas e maior potencial combinatório em comparação com as cadeias α. Métodos baseados em PCR podem amplificar simultaneamente as cadeias α e β, mas muitas vezes são separadas durante o sequenciamento para aumentar a precisão e especificidade do resultado.

A região CDR3 tem sido um alvo preferencial em muitos estudos de profilagem de TCR. Embora CDR1 e CDR2 não interajam diretamente com anticorpos, desempenham um papel vital no contato com as moléculas MHC e, assim, afetam a sensibilidade e afinidade da ligação do TCR.

• Preparação da Biblioteca

Existem três métodos comuns para a construção de bibliotecas de profilagem de TCR: PCR multiplex, enriquecimento direcionado e síntese de cDNA 5'RACE e PCR aninhado (Figura 2). Códigos de barras moleculares foram introduzidos durante a síntese de cDNA para minimizar o impacto de erros de PCR e sequenciamento.

Entre eles, as abordagens de PCR multiplex são as mais comuns e podem ser usadas tanto para gDNA quanto para RNA. Geralmente, primers para os alelos J ou a região constante das cadeias α e β, bem como primers para todos os alelos V conhecidos, são usados para amplificar o transcrito de TCR na região CDR3. No entanto, este método não pode detectar variantes de novos alelos V e pode introduzir vieses de amplificação.

Tanto a Agilent (SureSelectXT) quanto a Illumina (TruSeq) oferecem kits baseados em enriquecimento direcionado para capturar TCRs de células T αβ. O RNA ou gDNA são pré-processados e, em seguida, incubados com iscas de RNA projetadas sob medida para hibridizar com o alvo gDNA/cDNA, seguido por uma etapa de amplificação adicional. Os métodos de enriquecimento direcionado são menos suscetíveis a viés de PCR.

Para amostras de RNA, a amplificação rápida das extremidades de DNA complementar 5' (5'RACE) baseada na troca de template está se tornando um padrão ouro para estudos de TCR em massa. Comercializada pela Clonotech como tecnologia "SMART", este método permite o enriquecimento de todas as variantes de TCR na amostra. A Clonotech desenvolveu um kit comercial para estudos de TCR. A síntese de cDNA é realizada usando primers contra a região constante do transcrito de mRNA do TCR. Subsequentemente, é realizado um PCR aninhado para amplificar a região constante.

Figura 2. Fluxo de trabalho de três metodologias principais para preparação de bibliotecas de TCR (Rosati et al., 2017).

• Sequenciamento

O sequenciamento profundo permite a aquisição de um repertório de TCR mais completo. No entanto, para estudos orientados para doenças que procuram TCRs altamente expressos, um sequenciamento superficial de baixa cobertura pode ser suficiente. Neste caso, o Illumina MiSeq é comumente usado, enquanto o Illumina HiSeq é mais comumente utilizado para sequenciamento profundo.

Profilagem de TCR a partir de Dados de RNA-Seq

À medida que o sequenciamento do transcriptoma se torna rotineiramente utilizado em estudos básicos e clínicos, pode servir como uma fonte importante para a profilagem de TCR. Vários grupos desenvolveram ferramentas para a extração do repertório de TCR a partir de dados de RNA-seq em massa ou de célula única, como o MiXCR. Esta ferramenta visa extrair o maior número possível de sequências CDR3, quase sem falsos positivos.

Referências:

1. Bolotin D A, Mamedov I Z, Britanova O V, et al. Sequenciamento de nova geração para a profilagem do repertório de TCR: características específicas da plataforma e algoritmos de correção. European journal of immunology, 2012, 42(11): 3073-3083.
2. Bolotin D A, Poslavsky S, Davydov A N, et al. Profilagem do repertório de receptores de antígenos a partir de dados de RNA-seq. Nature biotechnology, 2017, 35(10): 908.
3. Hsu M S, Sedighim S, Wang T, et al. O sequenciamento de TCR pode identificar e rastrear células T infiltrantes de glioma após vacinação com DC. Cancer immunology research, 2016, 4(5): 412-418.
4. Rosati E, Dowds C M, Liaskou E, et al. Visão geral das metodologias para análise do repertório de receptores de células T. BMC biotechnology, 2017, 17(1): 61.
5. Luo W, Cui J H, Lin K R, et al. O repertório de TCR como um novo indicador para monitorização imunitária e avaliação de prognóstico de pacientes com câncer cervical. Frontiers in immunology, 2018, 9: 2729.