Como Resolver Problemas Comuns na Preparação de Sequenciação

Introdução: Quando a Preparação de Sequenciamento Corre Mal

Pode estar confiante no seu NGS pipeline—mas um pequeno erro na preparação da biblioteca pode arruinar toda a corrida. Imagine isto: você prepara uma biblioteca que apresenta resultados limpos no BioAnalyzer, mas a corrida de sequenciação retorna cobertura plana, altas taxas de duplicação ou sinais de dímeros de adaptadores anormalmente altos. Nesse momento, a sua primeira pergunta torna-se: Por que é que a minha biblioteca de sequenciação está a falhar?

Neste guia, dissecamos os mais comuns resolução de problemas de sequenciação desafios e erros de preparação de NGS que afetam laboratórios do mundo real. O nosso objetivo é mudar o seu fluxo de trabalho de depuração reativa para prevenção preditiva. Você vai aprender:

• Quais sinais de falha devem ser observados (por exemplo, baixo rendimento, contaminação do adaptador, viés)?
• Como diagnosticar causas raiz passo a passo
• Soluções comprovadas com base em experiências revisadas por pares e diretrizes da plataforma.

No final, não só resolverá o seu problema atual, mas também construirá um protocolo de preparação mais robusto que antecipa e evita falhas futuras.

Por que isto é importante:

• Bibliotecas falhadas desperdiçam reagentes, ciclos de sequenciação e tempo dos investigadores.

• A má qualidade da preparação transfere viés para os dados subsequentes, comprometendo os experimentos.

• Para CROs e núcleos partilhados, falhas repetidas erodem a confiança dos clientes e a capacidade de produção.

Também ligamos a recursos de fundo mais profundos dentro do nosso ecossistema de conteúdo — por exemplo, Preparação de Amostras para Resultados de Sequenciação de Alta Qualidade para QC de entrada a montante e Estratégias de Preparação de Bibliotecas para Sequenciação de Nova Geração para melhores práticas.

Problemas Comuns na Preparação de Sequenciamento e Suas Causas Raiz

Na prática, apenas um punhado de erros recorrentes representa a maioria das falhas na preparação de sequenciamento. Ao agrupá-los em categorias lógicas, podemos acelerar o diagnóstico e informar a ação corretiva. Aqui, dividimos quatro grandes categorias de problemas com a preparação de amostras, fragmentação/ligação, amplificação e limpeza, juntamente com as suas causas raízes típicas e sinais de falha.

Categorias de Problemas e Sinais de Falha

Análise Profunda de Cada Categoria

2.1 Exemplo de Entrada / Problemas de Qualidade

• Ácido nucleico degradadoSe o DNA/RNA de entrada estiver fragmentado ou com cortes (por exemplo, após a extração ou ciclos de congelamento-descongelamento), a complexidade da biblioteca diminui e os rendimentos baixos se seguem.
• Contaminantes, como fenol residual, EDTA, guanidina ou sais, podem inibir enzimas a montante (por exemplo, ligases, polimerases).
• Erros de quantificaçãoUsar apenas a absorbância (por exemplo, NanoDrop) pode superestimar o material utilizável porque conta o fundo não-template.
• Viés de cisalhamentoA fragmentação desigual (especialmente em regiões com alta GC ou estrutura secundária) pode distorcer os resultados.

Por exemplo, o guia de resolução de problemas da OGT recomenda verificar razões 260/280 e 260/230, avaliando as configurações de fragmentação e garantindo uma limpeza suficiente em torno da fragmentação.

2.2 Falhas de Fragmentação e Ligação

• Corte imprecisoUma fragmentação demasiado agressiva resulta em fragmentos excessivamente curtos; uma fragmentação demasiado suave resulta em heterogeneidade de tamanho.
• Baixa eficiência de ligaduraA ligadura é sensível à atividade enzimática, ao tampão de reação e às extremidades moleculares (cortadas vs adesivas).
• Desvio de molar para adaptador de inserçãoAdaptadores em excesso promovem dímeros de adaptadores; muito poucos reduzem o rendimento de ligadura.

As diretrizes de resolução de problemas da Thermo Fisher enfatizam que bibliotecas com dímeros de adaptadores apresentarão um pico agudo de ~70 bp (ou ~90 bp se codificadas). Nesses casos, a contaminação por adaptador ou a ligação ineficiente é frequentemente a culpada.

2.3 Problemas de Amplificação e PCR

• Excesso de ciclismoUltrapassar o número ótimo de ciclos de PCR introduz viés de tamanho, duplicados e achatamento da distribuição.
• Inibidores de enzimasSais ou fenol de carryover podem inibir polimerases durante a amplificação.
• Desajuste de primário ou exaustão do primárioOs primers podem hibridizar de forma inadequada sob condições de anelamento subótimas ou acabar prematuramente, resultando em falhas ou desvio.

Nos recursos da Thermo Fisher, eles alertam que é melhor repetir a amplificação a partir do produto de ligação restante do que sobreamplificar um produto fraco.

2.4 Erros de Purificação e Limpeza

• Relação de contas incorretaUsar a proporção errada de contas para volume da amostra pode excluir fragmentos desejados ou falhar na remoção de fragmentos pequenos.
• Secagem excessiva de contasSe as pérolas de bead se tornarem mate ou rachadas (em vez de brilhantes), a ressuspensão torna-se ineficiente.
• Sais ou contaminantes remanescentesPassos de lavagem inadequados levam à inibição a montante.
• Erro de pipetagemA divisão, a omissão de poços ou a mistura de colunas podem causar perda de amostras ou contaminação cruzada.

A Biocompare nota que muitas falhas na preparação manual são atribuídas a "não seguir as instruções com precisão" ou erros de pipetagem — por exemplo, descartar as esferas em vez do sobrenadante ou vice-versa.

Fluxo da Estratégia Diagnóstica

1. Verifique o eletroferograma. — procure picos agudos de 70–90 bp (dimers de adaptadores) ou distribuições largas/múltiplas.
2. Validação cruzada da quantificação — comparar contagens fluorométricas (por exemplo, Qubit) e contagens de qPCR vs absorbância.
3. Rastreie cada passo para trás. — por exemplo, se a ligadura falhar, analise a fragmentação e a entrada.
4. Controlo contra a contaminação — reutilizar controlos negativos e faixas em branco.
5. Rever os protocolos e os registos de reagentes para garantir que o lote do kit, a validade da enzima, a frescura do tampão e a calibração da pipeta estão corretos.

Exemplos de Casos de Resolução de Falhas na Preparação de Sequenciação

Abaixo estão dois exemplos concretos retirados da literatura existente ou de discussões da indústria. Cada um demonstra como as equipas de laboratório identificaram modos de falha e aplicaram soluções.

Exemplo 1: Queda no Rendimento da Biblioteca de Amplicons num Laboratório de Microbioma de Alto Rendimento

Um laboratório de sequenciação que lida com milhares de Bibliotecas de amplicões 16S notei que as concentrações finais da biblioteca tinham diminuído em comparação com execuções anteriores.

Sintomas:

• Muitas bibliotecas apresentaram concentrações molares baixas, apesar de entradas semelhantes.
• Os eletroferogramas mostraram uma presença aumentada de pequenos fragmentos (< 100 bp), consistente com artefatos de adaptadores ou primers não ligados.

Principais Conclusões:

• Os fatores de diluição utilizados na preparação dos templates de PCR foram mal calculados—as amostras foram subcarregadas, aumentando a probabilidade de os dímeros de adaptadores dominarem.
• Ao comparar a PCR de um passo (indexação numa única reação) com a indexação em dois passos, o método de dois passos mostrou uma melhor retenção dos amplicons-alvo e menos produtos secundários.
• Ajustar os parâmetros de limpeza das esferas (aumentando as proporções de esfera: amostra) melhorou a recuperação da faixa de fragmentos desejada.

Resultados e Lições:

• A correção do erro de diluição restaurou os rendimentos esperados da biblioteca.
• A mudança para indexação em duas etapas reduziu a formação de artefatos.
• A afinação da limpeza de beads tornou os perfis da biblioteca mais limpos.

Este caso mostra que até mesmo pequenos erros de cálculo ou a escolha do protocolo (indexação de um passo vs indexação de dois passos) podem fazer com que uma biblioteca passe de aceitável a falhada.

Exemplo 2: Armadilhas na Preparação Manual de Bibliotecas NGS numa Instalação Central Partilhada

Um laboratório central que realiza muitas preparações manuais de NGS (ou seja, sem automação total) encontrou falhas esporádicas que estavam correlacionadas com o operador, o dia ou o lote de reagentes.

Problemas Observados:

• Algumas amostras simplesmente não produziriam nenhuma biblioteca mensurável ou mostrariam picos fortes de adaptador/primer.
• As falhas apareceram de forma inconsistente—não estavam ligadas a um lote ou kit específico.
• Diferentes técnicos apresentavam diferenças subtis, mas reproduzíveis, nas taxas de sucesso de preparação.

Causas Raiz Identificadas:

• Desvios dos detalhes do protocolo: por exemplo, o método de mistura (vórtice vs pipetagem) ou o tempo diferiu entre os operadores.
• As soluções de lavagem de etanol perderam concentração ao longo do tempo ou evaporaram, levando a lavagens subótimas.
• Em algumas situações, os operadores descartaram acidentalmente as pérolas em vez do sobrenadante (ou vice-versa), especialmente em etapas repetitivas.

Passos Corretivos e Impacto:

• Introduziu "placas de desperdício" para apanhar material descartado temporariamente, permitindo a recuperação em caso de erro.
• Destacar passos críticos no SOP (por exemplo, com texto em negrito ou cor) para chamar a atenção.
• Mudou para misturas mestres para reduzir os passos de pipetagem e erros.
• Verificação cruzada obrigatória, listas de verificação dos operadores e registo redundante dos passos.

Com o tempo, o laboratório reduziu a frequência de falhas e melhorou a consistência entre os técnicos.

Comparações de Takeaway

Estes exemplos ilustram que muitas falhas na preparação de sequenciamento não se devem a bioquímica exótica, mas sim a pequenos erros de procedimento ou cálculos incorretos. O resto deste artigo irá basear-se nessas lições para ajudá-lo a localizar e corrigir sistematicamente esses pontos fracos.

Problema 1: Baixa Rentabilidade da Biblioteca — Causas e Soluções

Mesmo quando cada etapa parece correr sem problemas, um rendimento final da biblioteca inesperadamente baixo é um resultado frequente — e frustrante. Abaixo, analisamos as principais causas e oferecemos soluções acionáveis, com dicas específicas para cada plataforma quando aplicável.

4.1 Reconhecendo Baixo Rendimento

Antes de diagnosticar, verifique se o "baixo rendimento" é real:

• Compare métodos de quantificação (Qubit vs qPCR vs BioAnalyzer) — um pode superestimar ou perder moléculas amplificáveis.
• Examine os traços do eletroferograma: picos largos ou fracos, tamanhos de fragmentos-alvo em falta ou domínio de picos de adaptadores sugerem problemas.
• Verifique os registos de reagentes, números de lote e notas dos operadores em busca de anomalias.

Se o rendimento cair bem abaixo das expectativas (por exemplo, < 10-20 % do previsto), é necessário fazer uma análise sistemática.

4.2 Causas Principais de Baixa Produtividade e Como Corrigi-las

Abaixo está uma análise das causas raízes frequentes com estratégias corretivas.

4.3 Dicas e Exemplos Específicos da Plataforma

• Illumina / Preparações baseadas em tagmentação (por exemplo, Nextera XT): Os inibidores de enzimas (por exemplo, EDTA, proteínas, sais) prejudicam a ação da transposase e o rendimento. Utilize um input limpo e condições de tampão rigorosas.
• Fluxos de trabalho de captura/enriquecimento (por exemplo, SureSelect): As perdas ocorrem frequentemente após a captura durante a purificação com beads ou lavagens de hibridização. A Agilent recomenda verificar o manuseio das beads, a frescura do etanol e os ajustes no número de ciclos de PCR.
• Baixa produção pós-captura em painéis enriquecidos: A documentação da OGT cita a transferência de adaptadores ou a interferência das esferas como causas; reter um pequeno volume (~2 µL) durante a limpeza pode ajudar.

4.4 Fluxo de Resolução de Problemas para Baixo Rendimento

1. Verificar a integridade e pureza do DNA/RNA de entrada — execute o TapeStation/Fragment Analyzer e reveja as razões 260/230 e 260/280.
2. Verificar a consistência da quantificação — compare Qubit vs qPCR vs UV; decida qual é confiável para o seu tipo de biblioteca.
3. Passo atrás no fluxo de trabalho:
   • Verificar perfil de fragmentação
   • Inspecionar o sucesso da ligadura do adaptador
   • Examinar vestígios de limpeza
   • Rever os passos de amplificação
4. Executar "mini controlos" em paralelo — por exemplo, reserve uma pequena alíquota para testar apenas a ligadura ou apenas a PCR, para restringir o ponto de falha.
5. Se a massa for limitada, re-amplifique a partir dos produtos de ligadura armazenados. em vez de começar tudo de novo.
6. Implementar mudanças incrementais e repetir. — mude um parâmetro de cada vez (por exemplo, a relação do adaptador, o volume da esfera) para isolar a solução.

Problema 2: Dimerização de Adaptadores e Contaminação

Os dímeros de adaptadores são uma das causas mais comuns e insidiosas de falhas em bibliotecas de NGS. Eles consomem capacidade de sequenciação, distorcem métricas de QC e reduzem leituras utilizáveis. Nesta seção, vamos explorar como esses artefatos surgem, como detectá-los e como corrigi-los.

5.1 O Que São Dimeros de Adaptador e Por Que Causam Problemas

• Um dímero de adaptador forma-se quando os adaptadores 5' e 3' ligam-se entre si sem um inserto de DNA interveniente. Estes dímeros transportam sequências de adaptadores completas, permitindo-lhes agrupar-se e sequenciar em células de fluxo.
• Porque são pequenos, os dímeros de adaptador agrupam-se de forma mais eficiente do que fragmentos mais longos, roubando leituras de moléculas genuínas da biblioteca.
• Em células de fluxo padronizadas, os dímeros são especialmente problemáticos; a Illumina recomenda limitar os dímeros a 0,5% ou menos para células de fluxo padronizadas e até 5% para os que não têm padrão.
• Mesmo percentagens baixas de dímeros (por exemplo, 1–5%) podem reduzir o rendimento efetivo de sequenciação e distorcer as análises de complexidade da biblioteca.

Nos eletroferogramas, os diméricos de adaptadores aparecem frequentemente como picos agudos na faixa de ~120–170 bp (o tamanho depende das sequências de adaptador e índice) que se situam abaixo da distribuição esperada dos fragmentos da biblioteca.

5.2 Causas Raiz Comuns de Dimerização de Adaptadores / Contaminação

A Thermo Fisher enfatiza que bibliotecas com adaptadores gratuitos (não ligadas ou auto-ligadas) apresentam maiores riscos de index hopping ou leituras quiméricas, especialmente em células de fluxo padronizadas.

5.3 Como Detetar Dimers de Adaptadores Precoce

• Eletroferograma / Traços do Analisador de FragmentosProcure picos acentuados abaixo da faixa de tamanho da biblioteca principal (por exemplo, ~120–170 bp).
• Sequências sobre-representadas / FastQC / módulos de conteúdo de adaptadoresA sequência exata do adaptador pode aparecer repetidamente se houver dímeros presentes.
• Gráficos de conteúdo por baseUm sinal plano ou repetitivo (chamadas de base constantes) no início dos ciclos de sequenciação pode indicar dímeros de adaptadores.
• Limiares de QCSe os adaptadores excederem 0,5% (células de fluxo padronizadas) ou 5% (outras células), muitas plataformas sinalizam a biblioteca como subótima.

A documentação da Agilent mostra que até dimers de 0,1 % podem ser detectados por analisadores de fragmentos sensíveis e sistemas TapeStation, indicando a importância de um controlo de qualidade sensível.

5.4 Estratégias Corretivas: Como Eliminar Dimers de Adaptadores

Nota: Cada limpeza adicional geralmente reduz modestamente o rendimento total — mas resgatar a biblioteca de uma contaminação excessiva por dímeros muitas vezes vale a pena o sacrifício.

5.5 Fluxo de Trabalho Diagnóstico Sugerido para Dimerização de Adaptadores

1. Executar QC imediatamente após a ligação. (usando um analisador de fragmentos ou BioAnalyzer) para verificar picos de dímeros.
2. Se detetadoaplique purificação adicional com esferas ou limpeza em gel.
3. Requantificar a biblioteca usando qPCR (que é menos afetado por fragmentos apenas de adaptadores).
4. Se o dímero permanecerconsidere reduzir a concentração do adaptador ou redesenhar as sequências do adaptador (por exemplo, com modificações de bloqueio).
5. Utilize indexação dual para mitigar a atribuição incorreta de leituras em execuções agrupadas.
6. Gravar e iterar — acompanhar quais configurações de rácio e purificação produzem o menor dímero em várias execuções.

Problema 3: Cobertura Desigual e Viés de GC

Mesmo com uma preparação de biblioteca aparentemente bem-sucedida, a cobertura desigual continua a ser um culpado silencioso que compromete a qualidade dos dados. Regiões com conteúdo de GC extremo—ou muito ricas em GC ou ricas em AT—podem estar sub-representadas ou ausentes. A uniformidade adequada da cobertura é crítica para ensaios quantitativos e chamada de variantes.

6.1 Por que ocorre o viés GC e o seu impacto

• Viés de amplificação por PCR é um fator principal: as polimerases amplificam preferencialmente regiões de GC moderado, enquanto regiões extremas de GC ou AT são eliminadas (nota técnica da Thermo Fisher).
• A fragmentação e a ligadura podem também introduzir viés se as condições da enzima ou da reação favorecerem sequências particulares.
• Em fluxos de trabalho de captura/enriquecimento híbrido, a eficiência de ligação das sondas é afetada pelo conteúdo de GC, o que distorce o sucesso da captura.
• Bioinformaticamente, a cobertura desigual complica a montagem de novo, a análise de CNV e a chamada de variantes. Em casos extremos, a montagem falha para locos pobres em GC ou ricos em GC (Chen et al., 2013).
• Em aplicações metagenómicas ou multiplexadas, o viés de GC distorce as abundâncias relativas de espécies com conteúdo de GC divergente (estudo da GigaScience).

Devido a isso, até mesmo bibliotecas "boas" podem ocultar a sub-representação sistemática em regiões críticas.

Fig 1. Fontes de conjuntos de dados para análise de viés de GC em sequenciação de metagenomas

6.2 Identificação de Viés de GC nas Suas Bibliotecas

• Gráficos de Cobertura vs GCApós a mapeação, represente a cobertura normalizada através de janelas agrupadas por %GC. Uma curva de "sorriso" ou "careta" indica viés.
• Módulos de correção de viés Illumina / DRAGENAlgumas plataformas aplicam automaticamente a correção de viés GC no processamento posterior.
• FastQC / Qualimap relatórios de desvios de conteúdo de GC em relação à referência.
• Métricas como a penalização base Fold-80, especialmente em estudos de enriquecimento de alvos, destaca quantas leituras são necessárias para trazer 80% das bases até a cobertura média.
• Fique atento ao "dropout" nos bins de AT ou GC (métricas AT_DROPOUT / GC_DROPOUT do Picard).

Se você notar uma subcobertura sistemática em certos bins de GC, tem um problema de viés.

6.3 Principais Causas e Estratégias Corretivas

Exemplo da literatura:

Na otimização de um sistema genómico bacteriano misto de alto e baixo GC da QIAGEN, foi desenvolvida uma mistura de amplificação de biblioteca que manteve uma cobertura equilibrada em diversos conteúdos de GC, reduzindo significativamente a perda nas extremidades de GC.

6.4 Fluxo de Trabalho Prático para Corrigir o Viés de GC

1. Executar um piloto com múltiplas polimerases. na mesma entrada. Compare a uniformidade da cobertura.
2. Titular o número de ciclos de PCRexecute 10, 12, 14, 16 ciclos e compare as curvas de viés.
3. Aditivos ou melhoradores de teste (e.g., betaína, DMSO, trehalose) em regiões problemáticas em pequenos ensaios.
4. Aumentar o tempo de rampa ou alongar os passos. no protocolo de termociclagem, particularmente para desnaturação e anelamento.
5. Se a entrada permitir, utilize preparação sem PCR ou de baixo ciclo. para reduzir o preconceito.
6. Na captura de fluxos de trabalho, equilibrar o design da sonda. e otimizar os parâmetros de hibridação (temperatura, tempo, tampão).
7. Acompanhar métricas ao longo das execuções (Fold-80, bins GC, dropout) para refinar parâmetros gradualmente.

Problema 4: Contaminação Cruzada de Amostras ou Salto de Índice

Na execução de sequenciamento multiplexado, uma pequena fração de leituras pode acabar atribuída incorretamente a outra amostra. Esta sutil má atribuição—conhecida como saltar de índice ou mudança de índice—pode confundir a análise subsequente, especialmente quando está à procura de variantes de baixa frequência ou a trabalhar com bibliotecas de baixa complexidade.

7.1 O Que É Index Hopping e Suas Consequências

• Mudança de índice ocorre quando o índice (código de barras) de uma molécula de biblioteca é transferido para outra molécula durante a amplificação de clusters, levando a uma atribuição incorreta na desmultiplexação.
• É mais provável que esteja ligado. células de fluxo padronizadas usando ExAmp química, onde adaptadores livres ou oligonucleotídeos errantes podem hibridizar a modelos não intencionais.
• As taxas reportadas variam de ~0,1 % a 2 % (ou mais), dependendo da preparação da biblioteca, do tipo de célula de fluxo e da remoção de adaptadores livres.
• Mesmo níveis baixos de saltos podem introduzir leituras fantasma ou "crosstalk" que aparece como contaminação, interferindo na chamada de variantes ou na deteção de baixa abundância (por exemplo, em ensaios de célula única ou metagenómicos).
• Porque a alteração de índice é frequentemente subtil, pode passar pelo controlo de qualidade se não for verificada explicitamente, especialmente em experiências em massa. Mas para ensaios sensíveis, ignorá-la pode causar falsos positivos.

7.2 Causas Comuns de Má Atribuição entre Amostras

A nota técnica da Thermo Fisher enfatiza que usar índices duais únicos (IDU) é a forma mais fiável de mitigar a mudança de índice, tornando as leituras alteradas identificáveis e descartáveis a nível computacional.

7.3 Como Detectar Index Hopping ou Contaminação Cruzada

• Combinações de índices indeterminados/desajustadosNos relatórios de demultiplexagem, as leituras atribuídas a combinações de índices não utilizadas na sua folha de amostras indicam saltos.
• Taxas de contaminação acima dos limiares esperadosUma pequena percentagem de leituras a mapear para amostras não relacionadas (especialmente quando partilham uma corrida) é um sinal de alerta.
• Leituras em excesso nas faixas de controlo negativo ou em brancosSe os controlos em branco mostrarem leituras, isso pode ser devido a contaminação por índice ou saltos.
• Métricas de vazamento de leitura de amostras cruzadasAlgumas ferramentas (por exemplo, o software de desmultiplexação da Illumina) reportam índices de contaminação cruzada.
• Presença de variante inesperadaVariantes de baixa frequência que aparecem em múltiplas amostras (especialmente amostras sem razão biológica) sugerem partilha de leituras.
• QC dos sinais do adaptador / resíduos livres do adaptadorPicos elevados de adaptadores livres na análise de fragmentos podem correlacionar-se com o risco de saltos.

7.4 Estratégias para Prevenir ou Mitigar o Index Hopping

7.5 Verificações de Monitorização e Fluxo de Trabalho Recomendadas

1. Incluir controlos em branco / poços de índice negativo no seu design de sequenciamento para estimar a movimentação de fundo.
2. Rastrear o vazamento por índice nos registos de desmultiplexação — nunca ignores o resumo de "par de índices desconhecidos" ou "leituras indeterminadas".
3. Correlacione os picos do adaptador livre com o sangramento do índice.resíduos de adaptadores mais elevados costumam alinhar-se com maior interferência.
4. Executar pequenos grupos multiplexados em piloto. para avaliar a taxa de salto base do seu sistema.
5. Se a sensibilidade de deteção for crítica (por exemplo, variantes raras)considere descartar leituras ambíguas ou aplicar filtros de índice mais rigorosos.

Fig 2. Fluxos de preparação de bibliotecas.

Tabela de Referência Rápida & Melhores Práticas / Conclusões

8.1 Referência Rápida: Tabela Resumo de Resolução de Problemas

Aqui está um resumo compacto que pode manter na bancada ou em documentos de protocolo:

8.2 Melhores Práticas para Prevenir Falhas na Preparação de Sequenciamento

Para reduzir a frequência de resolução de problemas, incorpore as seguintes práticas no seu fluxo de trabalho:

1. Impor Controlo de Qualidade Rigoroso em Cada Etapa

• Avaliar integridade e pureza da entrada antes da fragmentação (por exemplo, TapeStation, 260/230, 260/280).
• Após cada etapa significativa (fragmentação, ligadura, purificação, amplificação), realize uma análise de fragmentos ou verificações de controlo de qualidade.
• Use ambos fluorométrico (e.g., Qubit) e quantidade amplificável métodos de qPCR para quantificação para detetar moléculas "escuras".

2. Titular Reagentes Críticos

• Executar adaptador: inserir proporções de titulações em corridas piloto iniciais.
• Para etapas baseadas em enzimas (fragmentação, ligação, PCR), teste reagentes ou fornecedores alternativos.
• Documente os resultados e reutilize os parâmetros com melhor desempenho para os seus tipos de amostra.

3. Minimizar o Erro Humano

• Utilize misturas mestres para reduzir os passos de pipetagem.
• Realce ou coloque em negrito os passos críticos do protocolo para manter a atenção.
• Utilize "pratos de desperdício" ou bandejas de captura para reter reagentes descartados acidentalmente.
• Treine e certifique técnicos; utilize listas de verificação e registos redundantes. A Biocompare nota que muitas falhas de preparação resultam de desvios nos protocolos ou lapsos de atenção.

4. Limpe Tudo Minuciosamente

• Prepare os tampões de lavagem frescos (por exemplo, etanol a 70%) para evitar desvios de concentração ou evaporação.
• Limpe as estações de trabalho e as pipetas, e separe as zonas de pré-PCR e pós-PCR.

5. Utilize Indexação Dual Única (UDI) Sempre que Possível

• Os UDIs permitem a identificação e filtragem de leituras que saltam índices.
• Evite reutilizar pares de índices combinatórios entre amostras.
• Slots de índice "em branco" reservados ou controlos negativos ajudam a detectar o derrame de índice de fundo.

6. Prossiga de Forma Incremental

• Ao solucionar problemas, mude apenas uma variável de cada vez (rácio do adaptador, rácio da pérola, contagem de ciclos).
• Mantenha alíquotas de backup de intermediários (por exemplo, pós-ligação) para permitir re-execuções parciais.

7. Acompanhar Métricas ao Longo do Tempo

• Registar métricas de QC (rendimento, taxa de duplicados, curvas de viés de GC, percentagem de adaptadores) em todas as corridas.
• Utilize a monitorização de tendências para detetar desvios ou degradação de reagentes.
• Os benchmarks ajudam a decidir quando atualizar os reagentes ou recalibrar os instrumentos.

8. Utilizar Sistemas de Gestão da Qualidade

• Para laboratórios maiores ou de serviços, integre os passos do protocolo num sistema de gestão da qualidade (SGQ) para padronizar operações e minimizar variações.
• Iniciativas da indústria (por exemplo, a Iniciativa de Qualidade NGS do CDC) fornecem diretrizes e ferramentas para os laboratórios.

Conclusão: Da Resolução de Problemas à Preparação Fiável de Sequenciamento

Até agora, você percorreu os principais modos de falha que ameaçam biblioteca NGS prep—baixo rendimento, dímeros de adaptadores, viés de GC e atribuição incorreta de índices—e vimos como cada um pode, silenciosamente, erodir a qualidade dos seus dados. Embora estes problemas frequentemente surjam de desvios aparentemente menores no protocolo ou subtilezas dos reagentes, as soluções são geralmente incrementais e sistemáticas em vez de radicais.

Principais conclusões a levar em frente:

• Comece sempre com entrada de alta qualidade—a baixa pureza ou integridade do DNA/RNA compromete os riscos a montante.
• Inserir pontos de controlo QC estratégicos após a fragmentação, ligadura, purificação e amplificação para detectar problemas precocemente.
• Aplicar solução de problemas metódica—mude uma variável de cada vez, mantenha alíquotas e registe os resultados.
• Usar melhores práticas para prevenir falhas: titulação de adaptadores, indexação dupla, misturas mestres, SOPs detalhados e formação de operadores.
• Monitorizar tendências ao longo do tempo—desvios nos rendimentos, métricas de QC ou taxas de dímeros frequentemente precedem falhas sistemáticas.
• Quando os problemas persistem, não hesite em procurar apoio especializado: abra um caso de suporte técnico, solicite uma revisão do protocolo ou repita etapas críticas com reagentes alternativos.

Os Seus Próximos Passos e Como Podemos Ajudar

1. Avalie a sua própria preparação.executar variantes lado a lado (por exemplo, quantidade de adaptador, polimerase, rigor de limpeza) e comparar métricas.
2. Integrar ciclos de feedbackalimente os seus dados de QC num painel de métricas de laboratório para detectar desvios precocemente.
3. Entre em contacto com a nossa equipa. para serviços de sequenciamento completo — tratamos de tudo, desde a preparação de amostras até a entrega de dados, incluindo auditorias de protocolos e resolução de problemas adaptadas às suas amostras.
4. Explore recursos relacionados:
   • Preparação de Amostras para Resultados de Sequenciação de Alta Qualidade — cobertura mais aprofundada do QC de entrada
   • Estratégias de Preparação de Bibliotecas para Sequenciação de Nova Geração — mais fluxos de trabalho e otimização de reagentes
   • Controlo de Qualidade Antes da Sequenciação: Garantindo a Integridade dos Dados — estratégias avançadas de QC

Referências:

1. Zouganelis GD, Tairis N. Sequenciação de Ciclo Direto de Baixo Rendimento de Produtos de Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR). Métodos Mol Biol. 2023;2633:195-211. doi: 10.1007/978-1-0716-3004-4_15. PMID: 36853466.
2. Zouganelis, G.D., Tairis, N. (2023). Sequenciação de Ciclo Direto de Baixo Rendimento de Produtos de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). In: Scarlett, G. (eds) Manipulação e Análise de DNA. Métodos em Biologia Molecular, vol 2633. Humana, Nova Iorque, NY.
3. Li, Q., Zhao, X., Zhang, W. et al. Sequenciação multiplex fiável com raras atribuições incorretas de índice na plataforma de NGS baseada em DNB. BMC Genómica 20, 215 (2019).
4. Patrick Denis Browne, Tue Kjærgaard Nielsen, Witold Kot, Anni Aggerholm, M Thomas P Gilbert, Lara Puetz, Morten Rasmussen, Athanasios Zervas, Lars Hestbjerg Hansen, O viés de GC afeta reconstruções genómicas e metagenómicas, subrepresentando organismos pobres em GC., GigaScience, Volume 9, Edição 2, Fevereiro 2020, giaa008