Preparação de Amostras para Resultados de Sequenciação de Alta Qualidade

Por que a Qualidade da Amostra Determina o Sucesso do Sequenciamento

No mundo da sequenciação de próxima geração (NGS), a qualidade da sua amostra de entrada é frequentemente o único fator mais significativo para o sucesso — ou falha. Mesmo com o sequenciador mais avançado e o kit de preparação de bibliotecas, DNA/RNA degradado, impuro ou de baixo rendimento pode comprometer toda a corrida.

Razões principais pelas quais a qualidade da amostra é importante

A eficiência enzimática depende da pureza.

Os passos de preparação da biblioteca—reparo das extremidades, ligação de adaptadores e amplificação por PCR—são impulsionados por enzimas. Contaminantes como fenol, sais ou etanol residual inibem estas enzimas.

A integridade do fragmento afeta o rendimento de sequenciação.

O DNA altamente fragmentado ou com cortes leva a uma geração de clusters ineficiente ou a um mapeamento de leituras de menor qualidade. Em amostras derivadas de tecido, uma menor integridade do DNA está associada a taxas de sucesso significativamente mais baixas. (Kuwata et al.; dados do NCI SCRUM-Japan)

3. Os erros de quantificação propagam-se a jusante.

A medição imprecisa da concentração de ADN leva a uma carga insuficiente ou excessiva no sequenciador. A sobrecarga reduz a qualidade dos clusters; a subcarga desperdiça capacidade. Ensaios fluorométricos (Qubit, PicoGreen) são preferidos em relação à espectrofotometria para a quantificação precisa de ácidos nucleicos.

4. Baixo input aumenta a sensibilidade à contaminação.

Em amostras com escasso DNA, até mesmo quantidades mínimas de DNA exógeno (por exemplo, de reagentes ou do ambiente) podem distorcer os resultados. Estudos de leituras não mapeadas mostraram que amostras diluídas são particularmente suscetíveis a artefatos de contaminação. (Lusk, 2014)

Impacto: a integridade prevê o sucesso

Numa análise extensa de tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) (n = 2.573), amostras com alta integridade do DNA (ΔCt < 4,4 pela métrica de qPCR) resultou em taxas de sucesso de NGS de ~94%. Em contraste, amostras de baixa integridade tiveram taxas de sucesso de ~5,6%. (Kuwata et al.)

Este resultado sublinha um ponto central: nenhum "resgate" a montante pode compensar totalmente um material de partida de má qualidade. No momento em que compromete a qualidade da amostra, reduz a sua margem de erro em cada passo subsequente.

Passos Essenciais na Preparação de Amostras para Sequenciação

Para converter de forma fiável material biológico bruto em ácidos nucleicos prontos para sequenciação, os laboratórios devem seguir um fluxo de trabalho disciplinado e passo a passo. Abaixo está um roteiro refinado, juntamente com advertências e melhores práticas.

2.1 Coleta e Estabilização de Amostras

• Escolha tubos de coleta ou conservantes que inibam nucleases ou o crescimento microbiano (por exemplo, EDTA para sangue, RNAlater para RNA).
• Minimize o número de ciclos de congelamento-descongelamento—cada ciclo degrada os ácidos nucleicos de forma incremental.
• Registar metadados da amostra (fonte, tempo, histórico de temperatura) para sinalizar variabilidade anómala mais tarde.

Por que é importante: O manuseio inadequado nesta fase amplifica artefatos a montante, como fragmentação, contaminação ou perda.

2.2 Extração de DNA / RNA

Este passo fundamental isola ácidos nucleicos de células, tecidos ou fluidos. A escolha do método (baseado em coluna, esferas magnéticas, fenol/clorofórmio ou sistemas automatizados) depende do tipo de amostra, do rendimento e dos requisitos de pureza.

Principais considerações e melhores práticas:

• Utilize reagentes e consumíveis certificados e isentos de nucleases (pontas, tubos, pontas de pipeta com filtro).
• Após a lise, assegure a remoção completa de proteínas, sais, detergentes, fenol e etanol residual. A Illumina alerta que inibidores residuais (por exemplo, fenol, EDTA, ácidos húmicos) podem interferir na reparação final, ligação ou PCR.
• Para algumas matrizes desafiadoras (por exemplo, plantas, solo, FFPE), considere um passo extra de limpeza ou purificação (por exemplo, repurificação em coluna de centrifugação) para remover inibidores.
• Escolha um tampão de eluição compatível com os passos seguintes (por exemplo, 10 mM Tris, pH 7,5–8,5). A Illumina sugere evitar tampões com alta concentração de EDTA ou ácidos que possam reduzir a atividade enzimática.
• Para fluxos de trabalho de alto rendimento, plataformas automatizadas baseadas em esferas magnéticas (por exemplo, sistemas Thermo Fisher KingFisher) oferecem consistência e redução de erros manuais.

2.3 Quantificação e Controlo de Qualidade (CQ)

Após a extração, valide a intensidade, pureza e integridade do seu ácido nucleico antes de prosseguir.

Verificações críticas a realizar:

• Rácios de pureza (A260/280, A260/230): A espectrofotometria UV básica revela contaminação com proteínas, fenol ou sal. Faixas aceitáveis: A260/280 ~1,8 para DNA, ~2,0 para RNA; A260/230 idealmente > 1,8. A Illumina recomenda estes como um primeiro rastreio.
• Quantificação fluorométrica (Qubit, PicoGreen): Mais preciso para a quantificação de ácidos nucleicos de cadeia dupla. O guia de preparação de DNA da Illumina alerta explicitamente contra a dependência exclusiva de métodos UV.
• Avaliação de integridade/fragmentação:
• – Eletroforese em gel ou traços do TapeStation / Bioanalyzer (para DNA)
• – Número de Integridade do RNA (RIN) ou métricas equivalentes para RNA
• Ensaios de QC opcionais:
• – Pequena amplificação PCR de "teste" para detetar inibidores
• – Controlo spike-in ou padrão sintético para monitorizar o viés de rendimento
• Documente todas as métricas de QC no seu caderno de laboratório ou sistema LIMS para ajudar a diagnosticar falhas posteriormente.

2.4 Armazenamento e Transporte de Amostras de Ácidos Nucleicos

Preservar a integridade da amostra após a extração é tão importante quanto a própria extração.

Diretrizes para armazenamento e envio:

• Curto prazo: Mantenha os alíquotas a 4 °C se forem processados dentro de algumas horas; caso contrário, a –20 °C.
• A longo prazo: Armazenar a –80 °C (especialmente para RNA).
• Buffer: Utilize tampão TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA) a pH 7,5 para DNA; evite catiões divalentes ou tampões que promovam a degradação.
• Evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento: Divida as amostras em volumes menores.
• Cadeia de frio durante o transporte: Utilize gelo seco ou caixas de transporte validadas para manter a temperatura. Registe a temperatura com registadores de dados.
• Rotulagem e metadados: Incluir identificadores, concentração, métricas de QC e histórico de manuseio.

Como Melhorar a Qualidade do DNA para NGS

Mesmo um protocolo de extração bem concebido pode produzir ADN subótimo se detalhes menores forem negligenciados. Abaixo estão táticas refinadas e melhores práticas para levar a qualidade da sua amostra a níveis quase ideais para sequenciação.

3.1 Utilizar Material de Partida de Alta Integridade

• Sempre que possível, comece com tecido coletado recentemente ou congelado rapidamente. Congelações e descongelações repetidas degradam o DNA ao longo do tempo.
• Para espécimes desafiadores (por exemplo, FFPE, amostras arquivadas antigas), considere direcionar amplicões mais curtos ou usar captura híbrida em vez de sequenciação do genoma completo.
• Em estudos comparativos, os métodos de extração apresentam uma variação de ≥10% no rendimento e no tamanho dos fragmentos, dependendo do tipo celular e do protocolo de lise (ScienceDirect, artigo "Avaliação da qualidade do DNA").

3.2 Otimizar as Condições de Lise e Ligação

• Ajuste a composição do tampão (por exemplo, utilizando detergentes suficientes, proteinase K e concentrações ótimas de sal) para quebrar completamente as paredes celulares, membranas e complexos proteicos.
• Para amostras com alto teor de polissacarídeos ou fenólicos (por exemplo, plantas, solo), inclua etapas adicionais de purificação ou aditivos no tampão de ligação (por exemplo, PVPP, CTAB ou colunas de remoção de inibidores).
• Utilize uma mistura suave (por exemplo, rotação lenta) em vez de vortexação para evitar o corte mecânico do DNA genómico.
• Mantenha os tempos de incubação apenas o suficiente para a lise completa; a incubação excessiva em condições severas pode danificar as extremidades do ADN.

3.3 Evitar Inibidores e Contaminantes de Transfusão

• Após os passos de ligação e lavagem, remova cuidadosamente o etanol residual—não seque em demasia o pellet, pois isso pode tornar a re-dissolução ineficiente.
• Use uma lavagem extra (por exemplo, 70 % de etanol) ou um passo de "buffer de lavagem + 80 % de etanol" ao trabalhar com contaminantes pegajosos.
• Inclua um passo de purificação com RNAse ou DNase (dependendo do alvo), quando necessário, para remover espécies de ácidos nucleicos indesejadas.
• Utilize uma etapa de centrifugação final ou de vácuo para remover sais residuais ou reagentes (por exemplo, guanidina, EDTA) que possam inibir enzimas posteriores.

3.4 Estratégias de Eluição Suaves

• Aqueça o tampão de eluição (por exemplo, 37 °C) antes de aplicar na coluna ou nas esferas; deixe incubar na matriz durante 2–3 minutos antes de centrifugar.
• Elua em tampão de baixa salinidade (por exemplo, 10 mM Tris, pH 7,5) ou água livre de nucleases (se aceitável) em vez de tampões que contenham demasiado EDTA.
• Utilize volumes de eluído que sejam apenas suficientes para a concentração sem sacrificar o rendimento. Para alguns utilizadores, duas eluições sequenciais de pequeno volume proporcionam uma melhor concentração e recuperação.

3.5 Utilize Automação e Consumíveis Limpos

• Plataformas automatizadas (por exemplo, robôs de esferas magnéticas) reduzem erros humanos e variação entre lotes.
• Utilize sempre pipetas com filtro, consumíveis estéreis e áreas dedicadas ao pré e pós-PCR para garantir o mais alto nível de segurança e precisão.
• Mantenha os estoques de reagentes adequadamente (evite descongelações repetidas) e audite-os regularmente para um desempenho ótimo.

3.6 Polimento Pós-Extração (Opcional mas Crítico para Amostras Difíceis)

• Para extratos de baixa pureza, aplique um kit de purificação (por exemplo, esferas SPRI, colunas de sílica) para remover ainda mais os inibidores.
• Se necessário, realize a seleção de tamanho para remover fragmentos muito curtos (por exemplo, <200 bp) que podem dominar durante a preparação da biblioteca.
• Use enzimas de reparação de DNA ou de polimento de extremidades para corrigir quebras, mas apenas quando o DNA inicial estiver razoavelmente intacto.

Fontes Comuns de Contaminação e Como Preveni-las

Mesmo quando cada passo molecular é tecnicamente sólido, a contaminação pode anular a sua corrida de sequenciação. Aqui, analisamos as rotas de contaminação frequentes e estratégias práticas de prevenção, apresentadas como um quadro de verificação para o laboratório.

4.1 Tipos de Contaminação em Fluxos de Trabalho de Sequenciação

4.2 Estratégias de Prevenção: Uma Abordagem em Lista de Verificação

Aqui está uma lista de verificação prática que pode adotar no seu laboratório para reduzir o risco de contaminação:

• ☐ Separar completamente as áreas de pré-PCR (ou pré-biblioteca) e pós-PCR/biblioteca.Nunca traga materiais de volta para montante.
• ☐ Usar equipamento e consumíveis dedicados em cada zona (pipetas, tubos, pontas de filtro).
• ☐ Reagentes alíquotos (e.g., primers, tampões) em frascos de uso único para minimizar aberturas repetidas.
• ☐ Utilize pontas de filtro resistentes a aerossóis. ou pipetas de deslocamento positivo.
• ☐ Descontaminar superfícies e ferramentas regularmente: lixívia (10–15 %), irradiação UV e reagentes de descontaminação de DNA.
• ☐ Inclua controlos negativos e brancos de extração. em cada execução de fluxo de trabalho.
• ☐ Rastrear números de lote de kits de reagentes e realizar verificações de antecedentes ou "execuções em branco" ao mudar de lotes. (A variabilidade do kit de reagentes ("kitome") demonstrou diferir entre lotes)
• ☐ Restringir o movimento de pessoal — trocar luvas, batas de laboratório ou colocar equipamento de proteção ao atravessar zonas.
• ☐ Minimizar ciclos de PCR, especialmente para regiões-alvo altamente amplificadas, para reduzir a sensibilidade ao carryover.
• ☐ Adotar dUTP + prevenção de carry-over com uracil-DNA glicosilase (UNG) na biblioteca ou preparação de PCR para degradar contaminantes de amplicão.

4.3 Método de Exemplo: UNG + dUTP para Controlo de Carry-Over

Para limitar a contaminação por amplificação carry-over, alguns laboratórios incorporam dUTP nos produtos de PCR e utilizam glicosilase de uracilo-DNA (UNG) antes de reações subsequentes. A UNG corta as bases de uracilo (em amplicons anteriores), tornando o DNA contaminante não amplificável, enquanto preserva os templates de DNA nativos sem uracilo.

Um protocolo publicado adaptou isto para a preparação de bibliotecas de PCR em duas etapas. Eles mostraram uma redução significativa na contaminação por carry-over, mantendo o rendimento e a diversidade da biblioteca.

4.4 Nota: Contaminação Baseada em Kits em Fluxos de Trabalho Metagenómicos

Um estudo recente examinou várias marcas de reagentes para extração de DNA e encontrou assinaturas distintas de "microbiota de fundo" únicas para cada lote de kit. Alguns reagentes continham DNA microbiano que poderia enviesar o perfil metagenómico se não fosse controlado.

Isto sublinha a importância de utilizar brancos de reagentes como controlos internos e de interpretar leituras de baixa abundância com cautela.

Lista de Verificação Prática para Controlo de Qualidade de Amostras

Abaixo está uma lista de verificação robusta e amigável para o laboratório que pode adotar para validar a qualidade do seu DNA/RNA antes de investir na preparação da biblioteca. Use isto como um guardião para detectar materiais de entrada de baixa qualidade precocemente.

⚙️Lista de Verificação de QC: Métricas Chave e Limiares

*Os limiares podem variar dependendo do protocolo da sua biblioteca e das quantidades de entrada; consulte sempre a documentação do seu kit.

Notas de Implementação e Melhores Práticas

• Documentar todas as métricas de QC no seu LIMS ou caderno de laboratório. Capture traços brutos (por exemplo, gel, eletroferograma) como anexos de ficheiro.
• Aplique os portões cedo. Se uma amostra falhar nos testes A260/230 ou fluorométricos, não desperdice reagentes a tentar preparar a biblioteca.
• Utilize QC replicado para amostras críticas. Especialmente para material de entrada precioso, execute duplicados de ensaios de quantificação ou integridade.
• Realize os brancos de reagente em paralelo. Processar controlos "sem DNA/RNA" para detetar contaminação do kit ou interferência de fundo.
• Sinalizar amostras limítrofes. Atribua-os a uma categoria de "monitorização" — prossiga com cautela ou com passos adicionais de limpeza.
• QC novamente após os passos de limpeza ou polimento. Se realizar limpezas adicionais com beads ou seleção de tamanho, repita a quantificação e os testes de integridade.

Link para Conteúdo Relacionado

Para mais informações sobre validação de bibliotecas pós-QC e métricas, consulte o nosso artigo "Controlo de Qualidade Antes da Sequenciação: Garantindo a Integridade dos Dados", onde aprofundamos em métricas como Q30, densidade de clusters e qualidade de leitura."

Além disso, este artigo está relacionado com "Estratégias de Preparação de Bibliotecas para Sequenciação de Nova Geração", que descreve como os portões de QC se integram em fluxos de trabalho de biblioteca eficientes."

Estudo de Caso: Como uma Preparação de Amostras Rigorosa Salvou o Sucesso do NGS em um Fluxo de Trabalho ao Estilo CRO

Numa recente análise institucional de sequenciação de tumores raros, cerca de 14,7 % dos corridas de sequenciamento falharam porque o material de entrada não atingiu a quantidade ou qualidade necessárias. (Itkin et al., 2025. DOI: https://doi.org/10.3892/mi.2025.226) Dos oito ensaios falhados que foram retestados, sete tiveram sucesso após reextração ou ajustes na preparação.

Lições para Ambientes de CRO

A partir desta experiência, as equipas de laboratório e os gestores de projeto podem adotar estas estratégias:

Na prática, aplicar estas lições no ambiente dos seus CROs poderia reduzir as taxas de falha de cerca de 10 % para menos de 3 %.

Figura 1 - Diagrama de fluxo do protocolo do estudo. NGS, sequenciação de nova geração.

Próximos Passos para Melhorar o Seu Fluxo de Trabalho de Sequenciação

Para aprofundar a sua compreensão e integrar perfeitamente a preparação de amostras na sua pipeline de sequenciação mais ampla, aqui estão três recursos altamente relevantes:

Como Projetar Primers para Sequenciação de DNA: Um Guia Prático — Aprenda como o design de primers impacta o sucesso subsequente e ajude a evitar o viés de amplificação.

Como Sequenciar um Gene: Fluxo de Trabalho do Experimento Passo a Passo — Explore o protocolo completo de ponta a ponta, colocando a preparação de amostras no seu contexto mais amplo.

Estratégias de Preparação de Bibliotecas para Sequenciação de Nova Geração — Mergulhe nos métodos para ligadura de adaptadores, seleção de tamanho e outros detalhes da construção da biblioteca.

Ao ligar as suas escolhas de QC e preparação a estes tópicos adjacentes, mantém um centro de conteúdo coeso que orienta os leitores em cada etapa do sequenciamento.

Conclusão Final

Resultados de sequenciação de alta qualidade começam muito antes do sequenciador—na preparação da amostra. Quando implementa rigorosos critérios de controlo de qualidade, controlo de contaminação e estratégias de backup, aumenta drasticamente a sua janela de sucesso.

Se gostaria de:

• Valide o seu processo de preparação existente.
• Desenvolva limites de QC personalizados para o seu laboratório.
• Garanta um projeto piloto de sequenciamento com desempenho garantido.

…a nossa equipa de sequenciação especializada está pronta para colaborar. Contacte-nos hoje. para rever o seu protocolo ou solicitar uma consulta.

Perguntas Frequentes

Q: O que causa a falha de sequenciação?

As falhas de sequenciação muitas vezes resultam de má qualidade da amostra — baixa integridade do DNA, contaminantes residuais (fenol, etanol, sais) ou inibidores do processo de extração podem bloquear etapas enzimáticas como a ligadura ou PCR. Ocasionalmente, a contaminação cruzada ou a transferência de reagentes podem sobrepor uma boa entrada e causar falha total.

Q: Como posso melhorar a qualidade do DNA para NGS?

Pode melhorar a qualidade do ADN utilizando material de partida fresco ou armazenado corretamente, otimizando as condições de lise para evitar a fragmentação, realizando etapas adicionais de purificação para remover inibidores, eluindo suavemente em tampão com baixo teor de sal e utilizando sistemas de extração automatizados com desempenho consistente.

Q: Quais são as métricas chave que devo verificar antes de prosseguir com a preparação da biblioteca?

Deve verificar as razões de pureza (A260/280 e A260/230), a concentração precisa por fluorescência (Qubit ou PicoGreen) e a integridade (gel, TapeStation ou Bioanalyzer). Um controlo em branco negativo ajuda a detectar contaminação de fundo antes de se comprometer com a preparação da biblioteca.

Q: Como posso prevenir a contaminação no meu fluxo de trabalho de sequenciação?

Prevenir a contaminação através da separação física das áreas pré e pós-PCR, uso de ponteiras filtrantes e instrumentos dedicados, descontaminação (água sanitária, UV), controles de reagentes, alocação de reagentes, restrição do movimento do pessoal e, opcionalmente, utilização de sistemas dUTP/UNG para eliminar amplicões remanescentes.

P: Posso resgatar amostras de DNA de baixa qualidade?

Às vezes. Se o DNA estiver moderadamente impuro ou levemente degradado, a aplicação de etapas de polimento (por exemplo, limpeza com esferas SPRI, seleção de tamanho, reparação de quebras) pode elevá-lo acima dos limiares de preparação da biblioteca. No entanto, o DNA severamente fragmentado ou fortemente contaminado muitas vezes não pode ser totalmente recuperado sem uma nova extração.

P: Por que é que a quantificação por UV (Nanodrop) é frequentemente pouco fiável?

A espectrofotometria UV mede todos os ácidos nucleicos e substâncias que absorvem, incluindo nucleótidos livres, primers e contaminantes, levando a uma superestimação. Métodos fluorométricos (por exemplo, Qubit) ligam-se especificamente ao DNA de cadeia dupla e são mais precisos para a preparação de bibliotecas.

Referências:

1. Lai Z, Su Y, Lin H, Wang S, Lin Y, Liang S, Chen W, Hsueh P. 2025. Decifrar o impacto da microbiota contaminante nos reagentes de extração de DNA nos fluxos de trabalho de sequenciação de próxima geração metagenómica. Microbiol Spectr 13:e03119-24.
2. Jansson L, Aili Fagerholm S, Börkén E, Hedén Gynnå A, Sidstedt M, Forsberg C, Ansell R, Hedman J, Tillmar A. Avaliação da qualidade do DNA para preparação de bibliotecas de genoma completo. Bioquímica Analítica. Dez 2024;695:115636. doi: 10.1016/j.ab.2024.115636. Publicado online a 5 de agosto de 2024. PMID: 39111682.
3. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I. et al. Primer-BLAST: Uma ferramenta para desenhar primers específicos para alvos para a reação em cadeia da polimerase. BMC Bioinformática 13, 134 (2012).
4. Wright CF, Morelli MJ, Thébaud G, Knowles NJ, Herzyk P, Paton DJ, Haydon DT, King DP. Além do consenso: dissecando a diversidade da população viral intra-hospedeiro do vírus da febre aftosa através da utilização de sequenciação de genoma de nova geração.. J Virol. Mar 2011;85(5):2266-75. doi: 10.1128/JVI.01396-10. Epub 15 de Dezembro de 2010. PMID: 21159860; PMCID: PMC3067773.
5. Kopernik, A., Sayganova, M., Zobkova, G. et al. Validação Sanger de variantes de WGS. Sci Rep quinze, 3621 (2025).
6. Lusk RW. Contaminação diversa e generalizada evidente nas profundezas não mapeadas de dados de sequenciação de alto rendimento.. PLoS One. 2014, 29 de Outubro; 9(10): e110808. doi: 10.1371/journal.pone.0110808. PMID: 25354084; PMCID: PMC4213012.
7. Kuwata T, Wakabayashi M, Hatanaka Y, Morii E, Oda Y, Taguchi K, Noguchi M, Ishikawa Y, Nakajima T, Sekine S, Nomura S, Okamoto W, Fujii S, Yoshino T; SCRUM-Japan GI-SCREEN Grupo de Patologia. Impacto da integridade do DNA na taxa de sucesso do sequenciamento de próxima geração baseado em tecido: Lições do projeto nacional de rastreio do genoma do câncer SCRUM-Japan GI-SCREEN. Pathol Int. 2020 Dez;70(12):932-942. doi: 10.1111/pin.13029. Epub 2020 Out 8. PMID: 33030786; PMCID: PMC7820973.