Sequenciação do Terminal de Fagos: Técnicas e Benefícios

As regiões terminais de genomas de fágios abrigam elementos regulatórios críticos e determinantes estruturais essenciais para a infectividade e controlo do ciclo de vida. As plataformas convencionais de alto rendimento (por exemplo, Illumina) falham frequentemente em resolver estruturas de repetição terminal ou palindrómicas devido a limitações inerentes ao comprimento da leitura, criando lacunas persistentes nas montagens do genoma. As tecnologias de sequenciação de extremidades de fago abordam esta limitação fundamental, proporcionando a resolução necessária para gerar mapas genómicos completos e fechados.

Sequenciação do Terminal de Fagos permite a caracterização precisa dos terminais genómicos em bacteriófagos. Esta técnica é crítica para elucidar a arquitetura do genoma dos fágios e fornece dados essenciais para a investigação aplicada de fágios. Os avanços em genómica expandiram significativamente a sua utilidade em domínios-chave, incluindo a terapia com fágios, estudos de transferência horizontal de genes e aplicações de controlo biológico. Esta revisão examina de forma abrangente os princípios, as aplicações atuais e as vantagens prospectivas da tecnologia de sequenciação terminal.

Diversidade e Significado Biológico das Estruturas Terminais de Fagos

Os terminais do genoma do fago determinam diretamente os mecanismos de embalagem de DNA e as estratégias de infeção. Estas estruturas são classificadas em quatro tipos principais:

1. Fins Viscosas (cos sites)

• Sistema Modelo: fago λ
• Mecanismo: A terminase corta nos locais cosN, gerando saliências de cadeia simples de 12 pb 5' ou 3' que permitem a ciclagem.
• Significado Biológico: Garante a integridade do genoma e facilita vetores de terapia génica com engenharia de precisão.

2. Repetições de Terminal Direto (DTRs)

• Exemplar: Bacteriófago T7
• Característica: repetições idênticas de 160 bp flanqueando o genoma iniciam a replicação através de redundância terminal.
• Relevância Clínica: O comprimento do DTR modula a eficiência de recombinação e a conversão lisogénica (por exemplo, DTR de 378 bp no fago C. difficile phiCD211)

3. Embalagem Headful (sites pac)

• Representante: Fago P1
• Processo: A terminase reconhece os sites pac para o corte inicial; os cortes subsequentes dependem da capacidade do capsídeo (102%-110% do comprimento do genoma), resultando em genomas circularmente permutados com redundância terminal.
• Desafio Técnico: A clivagem imprecisa complica o mapeamento (por exemplo, o fago phiKZ de Pseudomonas aeruginosa requer sequenciação especializada)

4. Fins Aleatórios

• Fago T4
• Característica: Terminais altamente heterogéneos sem locais de clivagem conservados
• Requisito de Análise: Exige abordagens integradas de bioinformática e sequenciação de longas leituras.

Características Comparativas dos Terminais de Fagos

Ilustração de duas características principais do sequenciamento do genoma de fagos utilizadas para a previsão do término: Razão de cobertura vizinha (NCR) e frequência de borda de leitura (Chung CH et al., 2017)

Métodos de Tecnologia Fundamental

1. Sequenciação por Terminais de Sanger

• Princípio: Modifica o sequenciamento Sanger clássico para análise específica de terminais. Oferece alta precisão por leitura, mas com capacidade de produção limitada.
• Fluxo de Trabalho:
  • Processamento Terminal: A identificação crítica da topologia final dita a preparação:
    • Salientes de 5': Ligação direta compatível
    • *Extremidades de 3' salientes/cortadas:* Requerem tratamento com nuclease/polimerase para gerar terminais compatíveis com o vetor. Cosmídeos fornecem sequências de reconhecimento especializadas.
  • Sequenciação de Clones: Genomas de fago purificados ou fragmentos terminais são clonados em vetores de sequenciação (por exemplo, cosmídeos). Primers que visam regiões flanqueadoras do vetor permitem a sequenciação direcional dos terminais do inserto.
• Vantagens: Baixo custo, acessibilidade ao equipamento, precisão excecional de leitura única.
• Limitações: Baixo rendimento, dependência de clonagem, falha potencial com terminais instáveis.

Sequenciação por Tagmentação Baseada em Tn5

• Princípio: Utiliza a transposase Tn5 para fragmentar o DNA e ligar adaptadores de sequenciação simultaneamente.
• Fluxo de Trabalho:
  • Tagmentação In Vitro: Complexos de transposoma Tn5 engenheirados (pré-carregados com adaptadores Illumina) fragmentam o DNA fágico intacto e adicionam adaptadores de dupla indexação em uma única reação.
  • Enriquecimento Direcionado: PCR com primers complementares aos adaptadores Tn5 e regiões conservadas de fago amplifica fragmentos adjacentes terminais para sequenciação de alto rendimento.
• Vantagens: Protocolo simplificado (fragmentação/ligação de adaptadores em um único passo), alta eficiência, rentabilidade.
• Limitações: A resolução terminal é limitada pelo tamanho do fragmento; requer atividade de transposase otimizada e locais de primers altamente conservados.

3. Sequenciação de Longas Leituras de Molécula Única

• Princípio: Utiliza PacBio SMRT ou Tecnologias Oxford Nanopore (ONT) para sequenciar moléculas de comprimento total.
• Fluxo de trabalho:
  • Spanning de Terminal Direto: Leituras longas nativas atravessam terminais repetitivos ou estruturas em forma de alça sem fragmentação.
  • Sequenciação por Consenso Circular (CCS):
    • Ciclização do DNA de fago
    • A amplificação em círculo rolante gera repetições em tandem.
    • A sequenciação contínua através de locais de junção captura sequências terminais bidireccionais quando o comprimento da leitura excede o tamanho do genoma.
• Vantagens: Resolução de terminais sem montagem, lida com estruturas complexas/repetitivas.
• Limitações: Altos custos de instrumentação, preparação de biblioteca cara; taxas de erro bruto elevadas (mitigadas por modos CCS ou algoritmos de correção).

Para uma abordagem mais detalhada ao sequenciamento de fagos, consulte "Sequenciação do Genoma de Fagos: Métodos, Desafios e Aplicações.

Para mais informações sobre como construir e utilizar a base de dados de sequências de fagos, consulte "Construção e Utilização de Bases de Dados de Sequências Genómicas de Fagos" .

Avanços nas Tecnologias de Sequenciamento Terminal

PHAGETERM NGS Condutor

Deteção Automática de Fim através da Assimetria de Cobertura

• O PHAGETERM identifica os terminais de fago ao analisar padrões de cobertura de sequenciação:
  • fagos cos: Apresentam quedas acentuadas na cobertura terminal
  • fagos pac: Mostrar desvios de cobertura unimodal onde a intensidade do local de clivagem é igual a *1/(C+1)* (C = contagem de cópias em tandem)

Sistema de Classificação de Alta Precisão

• A plataforma distingue seis mecanismos de embalagem:
  • 5' cos fagos
  • 3' cos fagos
  • Fagos de repetição terminal direta (DTR) curtas/largas
  • Fagos com embalagem cabeçuda (pac)
  • Fagos sem fim (semelhantes ao T4)
  • Fagos transponíveis semelhantes ao Mu
    • Ele gera diretamente sequências terminais e determina precisamente os comprimentos de protrusão (por exemplo, a extremidade adesiva de 12 bp 5' do fago λ).

Automação e Usabilidade

• Análise com um clique: Gera relatórios gráficos (mapas de cobertura, gráficos SPC, tabelas de dados) a partir de dados de sequenciação brutos e genomas de referência.
• Compatibilidade ampla de dados: Funciona com bibliotecas padrão de pares de extremidades que requerem fragmentação aleatória (por exemplo, cisalhamento mecânico, excluindo métodos baseados em transposase como o Nextera)

Validação e Resolução de Problemas

• Verificação de dados SRA: Identificação precisa de fagos desconhecidos em conjuntos de dados públicos (por exemplo, o DTR de 443 bp do PBES-2 nos dados T3/T7)
• Solução de redundância terminal: Resolve ambiguidades na iniciação da montagem em fágicos DTR (por exemplo, repetições de 160 bp do T7)
• Manipulação de regiões complexas: Previne a má classificação de sequências repetitivas (por exemplo, fago Clostridioides phiCD146)

Aplicações de Domínios Cruzados

• Ensaios de transdução: Quantifica a contaminação de DNA do hospedeiro (transdução generalizada P1: 3,8% vs. fago λ: 0,01%)
• Estudos evolutivos: Algoritmo extensível à investigação de vírus arqueais e eucariotas (Garneau JR et al., 2017)

Cobertura de sequência na posição dos terminais (Garneau JR et al., 2017)

Sequenciação Metagenómica de Fagos Fluxo de trabalho

O DNA viral foi sequenciado em paralelo nas plataformas Illumina (leitura curta) e PacBio (leitura longa). Os dados resultantes foram montados utilizando estratégias de múltiplas ferramentas (Megahit, metaFlye, hybridSPAdes) para gerar contigs. Estes contigs foram agrupados em unidades taxonómicas operacionais virais não redundantes (VOTUs) através de:

• Remoção de redundância dentro da amostra
• Agrupamento VOTU (limite de similaridade de 95%)

A precisão genómica foi validada através da análise filogenética de grandes genes terminase. Os VOTUs receberam anotações a nível de família utilizando o PHAGCN.

Vantagens Tecnológicas

• Plataformas de Sequenciamento Complementares
  • Illumina: Captura precisamente sequências de fago de alta abundância
  • PacBio HiFi: Resolve regiões repetitivas e estruturas terminais complexas, melhorando a continuidade do genoma (↑hN50)
  • Montagem híbrida: Integra ambos os tipos de dados para produzir VOTUs mais completos.
• Sinergia de Ferramentas Múltiplas
  • Complementaridade de montagem: Ferramentas diferentes visam fagos específicos (por exemplo, o metaFlye destaca-se com fagos semelhantes ao T4)
  • Aperfeiçoamento da binagem:
    • AVAMB melhora a integridade do genoma (+17,6% em média)
    • vRhyme garante uma alta consistência taxonómica (96,7% de homogeneidade intra-bin)
• Recuperação de Genoma de Alta Qualidade
  • VOTUs específicos de ferramentas: Montadores individuais capturam subconjuntos únicos (54,5% VOTUs exclusivos do montador)
  • Integração de dados: Combinar saídas de múltiplas ferramentas aumenta os HQ-VOTUs em 4,8–21,7×.
• Confiabilidade da Validação Filogenética
  • As filogenias baseadas em genes de terminase demonstraram:
  • Distribuição uniforme de VOTUs de diferentes montadores dentro dos clados
  • Forte concordância com famílias de fagos estabelecidas (por exemplo, Autographiviridae)
• Limitações e Caminhos de Otimização
  • Lacunas na recuperação: Certas famílias (por exemplo, Rountreeviridae) evitam todos os montadores de leituras longas, necessitando de métodos direcionados.
  • Variabilidade de agrupamento:
    • O CONCOCT apresenta alta sensibilidade, mas baixa especificidade (52,7% de grupos inter-familiares).
    • O MetaBAT2 fornece uma precisão taxonómica superior (Wang H et al., 2024)

Fluxo de trabalho geral deste estudo (Wang H et al., 2024)

Valor Aplicado: Insights Translacionais da Análise do Terminal de Fagos

1. Engenharia de Mecanismos de Embalagem

• Orientação sobre Estruturas Terminais
  • A caracterização do sistema Cos/PAC permite um design de vetor otimizado para uma eficiência de embalagem aprimorada.
• Validação de Caso: Fago Pseudomonas PaP3
  • A sequenciação terminal confirmou um genoma linear de 44.249 pb com extremidades planas → Base para edição mediada por CRISPR.

2. Significado Taxonómico e Evolutivo

3. Otimização da Montagem do Genoma

• Vantagens do Mapeamento de Precisão:
  • Resolve controvérsias de conformação circular/linear
  • Reduz erros de montagem em 46% em estudos de fagos intestinais.
  • Eleva o contig N50 através de um posicionamento terminal preciso.

4. Desenvolvimento Terapêutico

• Aprimoramento da Segurança: Triagem de virulência terminal (por exemplo, deteção da toxina Shiga stx do fago λ)
• Sistema de entrega: um transportador auto-ciclante é projetado com base na extremidade viscosa do local cos para melhorar a eficiência da entrega in vivo.

Aplicações Clássicas

Validação da Sequência Terminal (Fago T3)

A confirmação da sequência terminal do fago T3 foi alcançada através da ligação de ligadores específicos seguida de sequenciação de alto rendimento. A análise comparativa com um grupo de controlo não modificado demonstrou um alinhamento exato entre as sequências predominantes nos dados de sequenciação e os terminais marcados com ligadores. Isto identifica de forma conclusiva estas sequências de alta frequência como as autênticas regiões terminais do genoma do fago.

2. Especificidade Terminal em Fagos do Tipo T4

A análise de fagos semelhantes ao T4 (por exemplo, IME08) revela sequências terminais não aleatórias, contradizendo suposições anteriores de completa aleatoriedade. Foram observados preconceitos sistemáticos, incluindo uma forte preferência pela guanina (G) como o nucleótido inicial. Esta descoberta desafia a compreensão convencional da sua arquitetura terminal.

3. Conservação Terminal Assimétrica em Fagos do Tipo N4

Os fagos semelhantes ao N4 (exemplificados pelo IME11) exibem uma acentuada assimetria terminal. As extremidades esquerdas do seu genoma apresentam uma significativa conservação e singularidade de sequência, enquanto os terminais direitos mostram uma organização heterogénea. Esta dicotomia estrutural destaca uma diversidade anteriormente não reconhecida nas configurações terminais dos fagos (Li SS et al., 2013).

Desafios Tecnológicos e Direções Futuras

Limitações Atuais

• Fagos Terminais Aleatórios: Ferramentas existentes como o PhageTerm apresentam sensibilidade limitada para fagos do tipo T4, necessitando do desenvolvimento de novos algoritmos.
• Sinais de Clivagem de Baixa Frequência: a deteção do sítio pac sofre de cobertura insuficiente e suscetibilidade ao ruído de sequenciação.

Caminhos de Inovação

• Sequenciação de Molécula Única: A sequenciação sem amplificação da Oxford Nanopore preserva as assinaturas de modificação terminal nativas.
• Framework de Análise Integrada: Combine o PhageTerm com sequenciação de terceira geração e deteção de variantes estruturais (por exemplo, SVjumper) para uma resolução abrangente de terminais.
• Predição Baseada em IA: Desenvolver modelos de aprendizagem profunda (por exemplo, TermiPredict) para identificar locais de clivagem utilizando características do domínio conservado da terminase.

Tabela 2: Comparação e Cenários de Aplicação das Tecnologias de Sequenciamento de Extremidades

ResumoA sequenciação de extremidades de fago emergiu como uma metodologia fundamental para avançar na utilização de recursos de fago. A sua importância advém da capacidade de permitir três funções críticas: elucidar os mecanismos de embalagem de DNA, aprimorar os processos de montagem do genoma e facilitar a engenharia direcionada de fagos.

Os avanços convergentes na sequenciação de moléculas únicas e na inteligência artificial estão prestes a desbloquear novas fronteiras:

• Correlação Estrutura-Função Final: Mapeamento da relação entre a arquitetura terminal e o seu impacto na eficiência de adaptação do hospedeiro.
• Sistemas de Entrega Inteligente: Engenharia de vetores terapêuticos precisos utilizando sinais de embalagem específicos de COS/PAC.
• Dinâmicas de Resistência a Antibióticos: Monitorização do transporte horizontal de genes de resistência nas regiões genómicas terminais de fagos em tempo real.

Referências:

1. Chung CH, Walter MH, Yang L, Chen SG, Winston V, Thomas MA. Predição de sequências de terminais do genoma de fagos do grupo Bacillus cereus utilizando dados de sequenciação de nova geração.. BMC Genómica4 de maio de 2017; 18(1):350.
2. Garneau JR, Depardieu F, Fortier LC, Bikard D, Monot M. PhageTerm: uma ferramenta para a determinação rápida e precisa dos terminais de fago e do mecanismo de empacotamento utilizando dados de sequenciação de nova geração.. Relatórios Científicos. 2017 15 de agosto;7(1):8292.
3. Wang H, Sun C, Li Y, Chen J, Zhao XM, Chen WH. Insights complementares sobre genomas virais intestinais: um referencial comparativo de metagenomas de leituras curtas e longas utilizando diversos assemblers e binners.. Microbioma. 20 de Dezembro de 2024;12(1):260.
4. Li S, Fan H, An X, Fan H, Jiang H, Chen Y, Tong Y. Análise dos terminais do genoma viral por sequenciação de alto débito. PLoS One2014, 20 de janeiro; 9(1):e85806.
5. Li SS, Fan H, An XP, Fan HH, Jiang HH, Mi ZQ, Tong YG. [Utilidade da tecnologia de sequenciação de alto débito na análise da sequência terminal do genoma de bacteriófagos caudovirales]. Bing Du Xue Bao. Jan 2013;29(1):39-43. Chinês. PMID: 23547378.